[发明专利]一种快速检测口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的方法

权利要求书

1.口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的检测引物，其特征在于，由1对引物BHK-1和BHK-2组成，序列如下：

上游引物BHK-1：5’-GGCTACGTACTACCATGAGG-3’；

下游引物BHK-2：5’-TCTGGGTCTCCGAGAACATC-3’。

2.一种快速检测口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的方法，使用权利要求1所述的口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的检测引物，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)，使用破乳剂对口蹄疫疫苗进行破乳；

步骤(2)，对步骤(1)破乳得到的水相层进行总RNA的提取；

步骤(3)，将步骤(2)得到的总RNA反转录为cDNA后，以cDNA为模板，以BHK-1和BHK-2为上下游引物，进行实时荧光定量PCR扩增，得到扩增产物；

步骤(4)，根据10倍梯度稀释Cytb质粒标准品的标准曲线，计算步骤(3)得到的扩增产物中Cytb的含量；如果含有Cytb，则为阳性，反之，为阴性，即无残留；

步骤(5)，将步骤(3)得到的扩增产物用限制性内切酶StuⅠ进行直接酶切，进一步验证基因的特异性，如果得到243bp和131bp条带大小为阳性，反之则阴性。

3.根据权利要求2所述的快速检测口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的方法，其特征在于，步骤(1)中，使用正丁醇作为破乳剂，在4℃的条件下静置60分钟，使油水分层，分离出含有抗原和细胞残留物的水相层；其中，破乳剂的加入的体积是口蹄疫疫苗体积的15％。

4.根据权利要求2所述的快速检测口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的方法，其特征在于，步骤(2)中，使用RNAiso Plus、氯仿和异丙醇进行总RNA的提取，具体的提取方法为：

向200μL水相层加入800μL RNAiso Plus，混匀，4℃静置10min，然后在10000rpm、4℃的条件下，离心10min，取上清液；

向上清液中加入体积为上清液体积一半的氯仿，混匀后，室温静置10min，接着在10000rpm、4℃的条件下，离心10min，取上清液并向该上清液中加入等体积的异丙醇，混匀后，室温静置10min，再在10000rpm、4℃的条件下，离心10min，取沉淀；

向沉淀中加入乙醇700μL，并在10000rpm、4℃的条件下，离心5min，去上清，并将该沉淀吹干，最后与30μL DEPC水混匀，置于-80℃进行保存。

5.根据权利要求2所述的快速检测口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的方法，其特征在于，将步骤(2)得到的总RNA反转录为cDNA的反应体系为10μL，包括：

RNase Free dH2O 4.5μL；

5×PrimeScript Buffer 2μL；

PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 0.5μL；

Random 6mers(100mol/L)0.5μL；

Oligo dT Primer(50mol/L)0.5μL；

总RNA 2μL；总计10μL；

反应程序为：37℃，15min；85℃，5s。

6.根据权利要求2所述的快速检测口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的荧光定量PCR的方法的PCR反应体系为25μL，其中包括：

Premix Ex taqTM Ⅱ 12.5μL；

上游引物BHK-1，10uM，0.5μL；

下游引物BHK-2，10μM，0.5μL；

ddH2O 9.5μL；

cDNA 2μL；总计25μL；

扩增程序为：

①95℃预变性30sec；

②95℃变性30s，62℃退火5s，共35个循环；

③每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测；

结束后，样本4℃保存。