[发明专利]一种快速检测口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的方法

说明书

本发明涉及一种快速检测口蹄疫疫苗中培养基质BHK‑21细胞残留的方法，属于生物技术领域。该方法是利用破乳剂对口蹄疫疫苗进行破乳，然后提取疫苗残留的总RNA，使用荧光定量RT‑PCR的方法检测残留细胞的Cytb基因，同时使用PCR‑RFLP技术对目的片段进行特异性分析，最后根据标准品的标准曲线，计算样品中Cytb的含量，从而达到快速、稳定检测口蹄疫疫苗中残留BHK‑21细胞残留的目的。本发明操作过程简单、可操作性强、周期短、灵敏度高、结果准确、重复性好，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测口蹄疫疫苗中培养细胞残留的方法，特别涉及一种利用实时荧光定量PCR的方法检测口蹄疫疫苗中BHK-21细胞残留的方法。

背景技术

口蹄疫是偶蹄动物携带的一种急性、热性和可快速远距离传播的传染病，感染对象是猪、牛、羊等主要畜种及其他家养和野生的偶蹄动物，易感动物多达70多种。传播快、感染性强，给畜牧业造成巨大的经济损失，严重影响国际贸易。素有“政治经济病”之称。由于其防控口蹄疫的措施主要是扑杀发病动物和应用质量可靠的灭活疫苗免疫易感动物。因此高质量安全的灭活疫苗对于口蹄疫防控至关重要。

口蹄疫疫苗的制备通常采用BHK-21细胞作为基质。BHK-21细胞又称幼仓鼠肾成纤维细胞，该细胞系是由I.A.Macpherson和M.G.P.Stoker于1961年从1日龄的仓鼠科仓鼠亚科金仓鼠属金仓鼠种金仓鼠肾脏建立了BHK-21亲本，随后84天连续培养，通过单细胞分离建立了13号克隆。这株细胞可用作转染宿主，用于表达包含选择及扩增标记的DNA的载体。BHK-21细胞广泛用于口蹄疫、狂犬病毒、乙脑病毒等病毒疫苗的生产基质。然而在口蹄疫疫苗的制作过程中容易残留培养基质细胞时所用的血清、水解乳蛋白，基质细胞蛋白等多种非目的蛋白成分。这些异源蛋白不仅导致注苗动物经常出现不同程度的不良反应，轻者减食、停食或发生流产，重者发生死亡，而且能够裂解病毒粒子，降低疫苗效力。目前口蹄疫的制苗工艺往往不能完全去除非目的蛋白成分，因此建立一种快速准确的非目的蛋白残留的检测方法，对于提高疫苗的生产效率和质量控制具有重要意义。

线粒体Cytb基因(细胞色素B基因)是一种蛋白质编码基因，几乎在所有真核生物和许多原核生物的线粒体中都有发现，在不同物种间序列长度没有明显差异，并且遗传变异小，但具有种间的差异。目前Cytb基因被广泛用于系统学研究，该基因片段包含着种内到种间甚至到科间的遗传进化信息，且在系统进化和分类研究、群体遗传结构研究等方面有很强的适用性。因此，本发明采用BHK-21细胞中的Cytb基因作为检测口蹄疫疫苗中是否含有基质细胞蛋白残留的特异性检测基因。该技术还未见报道。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种口蹄疫疫苗培养细胞BHK-21细胞残留物的快速检测方法，该方法具有简便迅速，结果准确和重复性好的特点，易于推广应用。

本发明采用的技术方案如下：

Cytb质粒标准品的构建：在美国国立生物信息中心NCBI基因库(Genbank)中检索获得BHK-21细胞Cytb基因的保守片段，利用基因克隆技术构建含有该保守基因序列的标准质粒分子。

口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的检测引物，是由1对引物BHK-1和BHK-2组成，序列如下：

上游引物BHK-1：5’-GGCTACGTACTACCATGAGG-3’；(SEQ ID NO.1)

下游引物BHK-2：5’-TCTGGGTCTCCGAGAACATC-3’。(SEQ ID NO.2)

本发明还提供一种快速检测口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的方法，使用上述的口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的检测引物，包括以下步骤：

步骤(1)，使用破乳剂对口蹄疫疫苗进行破乳；