[发明专利]口蹄疫病毒O、A和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒

权利要求书

1.用于口蹄疫病毒O型、A型和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT-PCR检测的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括：

O型FMDV检测引物和探针：

P1：5'-GSGCRCTCCTBCGNACK-3'

P2：5'-YRTGYTTSACWGCYASYTCYARR-3'

Probe-P7：5'-FAM-CYACYTACTAYTTCKCW-MGB-3'；

A型FMDV检测引物和探针：

P3：5'-CYGAGGCAGCACTGVAM-3'

P4：5'-CGGYGCYTTGTGGTAAGC-3'

Probe-P8：5'-VIC-CMCGAGCAACCCCA-MGB-3'；

AsiaⅠ型FMDV检测引物和探针：

P5：5'-AAGAGCACCCAAACCCTTGA-3'

P6：5'-GCCCCGACCAGTGTGTGT-3'

Probe-P9：5'-NED-CTCATGCAGATCCCCT-MGB-3'；以及

共用反转录引物P0：5'-CGGGAAACGCATGAGCAGTA-3'；

其中，S为G，C；R为A，G；B为C，G，T；N为A，C，G，T；K为G，T；Y为C，T；W为A，T；V为A，C，G；M为A，C。

2.含有权利要求1所述引物和探针的用于检测O、A和AsiaⅠ型口蹄疫病毒的三重实时荧光定量RT-PCR试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、逆转录酶、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，用于所述试剂盒的反转录体系为：5×M-MLV缓冲液4μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，20μmol/L共用反转录引物P01μL，M-MLV反转录酶0.5μL，RNase抑制剂0.5μL，样品RNA 10μL；反转录条件为：37℃，1h。

5.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，用于荧光定量RT-PCR扩增反应的反应体系以25μl计为：引物P1、P2、P3、P4、P5、P6终浓度各为0.4μmol/L，Probe-P7终浓度为0.4μmol/L，Probe-P8终浓度为0.6μmol/L，Probe-P9终浓度为0.6μmol/L，2.5mmol/L dNTPs2μL，10×Ex Taq酶缓冲液2.5μL，5U/μL Ex Taq DNA聚合酶0.25μL，cDNA模板4μL，去离子水补足至总体积25μL；

扩增反应条件为：94℃5分钟；94℃15秒，60℃30秒，共40个循环。