[发明专利]口蹄疫病毒O、A和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒有效
申请号: | 201510477153.X | 申请日: | 2015-08-06 |
公开(公告)号: | CN105112558B | 公开(公告)日: | 2018-02-06 |
发明(设计)人: | 闫若潜;吴志明;赵雪丽;谢彩华;刘梅芬;曹伟伟;王东方;王淑娟;马震原;李桂莲;董海岚;王一 | 申请(专利权)人: | 河南省动物疫病预防控制中心 |
主分类号: | C12Q1/70 | 分类号: | C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11 |
代理公司: | 北京路浩知识产权代理有限公司11002 | 代理人: | 王文君 |
地址: | 450008 河南省郑州*** | 国省代码: | 河南;41 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 口蹄疫病毒 asia 三重 实时 荧光 定量 rt pcr 检测 试剂盒 | ||
技术领域
本发明涉及口蹄疫病毒的分子生物学检测技术,具体地说,涉及口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型三重实时荧光定量RT-PCR(FQ-PCR)检测试剂盒。
背景技术
口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病,对偶蹄兽有重大危害。口蹄疫病毒共有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3(即南非1、2、3型)和Asia Ⅰ(亚洲Ⅰ型)7个血清型,我国主要是O、A和Asia Ⅰ型,各个血清型的病毒之间不能产生交叉免疫。因此,口蹄疫病毒快速准确的分型是口蹄疫诊断的重要内容,可为疫苗的选择和流行病学研究提供有价值的信息。
发明内容
本发明的目的是提供用于口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型三重实时荧光定量RT-PCR(FQ-PCR)检测的引物和探针。
本发明的另一目的是提供口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型三重FQ-PCR检测试剂盒。
为了实现本发明目的,本发明提供的用于口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型三重FQ-PCR检测的引物和探针,包括:
O型FMDV检测引物和探针:
P1:5'-GSGCRCTCCTBCGNACK-3'
P2:5'-YRTGYTTSACWGCYASYTCYARR-3'
Probe-P7:5'-FAM-CYACYTACTAYTTCKCW-MGB-3';
A型FMDV检测引物和探针:
P3:5'-CYGAGGCAGCACTGVAM-3'
P4:5'-CGGYGCYTTGTGGTAAGC-3'
Probe-P8:5'-VIC-CMCGAGCAACCCCA-MGB-3';
Asia Ⅰ型FMDV检测引物和探针:
P5:5'-AAGAGCACCCAAACCCTTGA-3'
P6:5'-GCCCCGACCAGTGTGTGT-3'
Probe-P9:5'-NED-CTCATGCAGATCCCCT-MGB-3';以及
共用反转录引物P0:5'-CGGGAAACGCATGAGCAGTA-3';
其中,S为G,C;R为A,G;B为C,G,T;N为A,C,G,T;K为G,T;Y为C,T;W为A,T;V为A,C,G;M为A,C。
本发明还提供含有所述引物和探针的用于检测O、A和Asia Ⅰ型口蹄疫病毒的三重实时荧光定量RT-PCR试剂盒。
优选地,所述试剂盒还包括dNTPs、逆转录酶、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液等中的一种或多种。
更优选地,所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。其中,所述阳性对照为经灭活的口蹄疫病毒O型、A型和Asia Ⅰ型标准株细胞培养物;所述阴性对照为正常细胞培养液。分别设置O型、A型和Asia Ⅰ型检测体系为FAM、VIC和NED荧光通道。
用于所述试剂盒的反转录体系为:5×M-MLV缓冲液4μL,2.5mmol/L dNTP 4μL,20μmol/L共用反转录引物P0 1μL,M-MLV反转录酶0.5μL,RNase抑制剂0.5μL,样品RNA 10μL;反转录条件为:37℃,1h。
用于荧光定量RT-PCR扩增反应的反应体系以25μl计为:引物P1、P2、P3、P4、P5、P6终浓度各为0.4μmol/L,Probe-P7终浓度为0.4μmol/L,Probe-P8终浓度为0.6μmol/L,Probe-P9终浓度为0.6μmol/L,2.5mmol/L dNTPs 2μL,10×Ex Taq酶缓冲液2.5μL,5U/μL Ex Taq DNA聚合酶0.25μL,cDNA模板4μL,去离子水补足至总体积25μL。
扩增反应条件为:94℃ 5分钟;94℃ 15秒,60℃ 30秒,共40个循环。
本发明进一步提供所述试剂盒在检测口蹄疫病毒和鉴别O、A和Asia Ⅰ型病毒中的应用。具体地,所述应用包括以下步骤:
1)提取待测病毒样品的总RNA,进行反转录获得cDNA;其中,反转录体系为:5×M-MLV缓冲液4μL,2.5mmol/L dNTP 4μL,共用反转录引物P0 1μL(20μmol/L),M-MLV反转录酶0.5μL,RNase抑制剂0.5μL,RNA 10μL;反转录条件为:37℃,1h。
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