[发明专利]一种化学品胚胎毒性预测模型及其建立方法

权利要求书

1.一种化学品胚胎毒性预测模型，其特征在于：包括细胞种类；所述细胞种类包括核型为XX的SP3ES细胞诱导分化出的心肌细胞。

2.如权利要求1所述的化学品胚胎毒性预测模型，其特征在于：还包括分子观测终点；所述分子观测终点包括Myl4。

3.如权利要求1所述的化学品胚胎毒性预测模型，其特征在于：所述细胞种类还包括核型为XY的R1ES细胞诱导分化出的心肌细胞。

4.如权利要求2所述的化学品胚胎毒性预测模型，其特征在于：所述分子观测终点还包括cTnT和/或Myh6。

5.如权利要求2所述的化学品胚胎毒性预测模型，其特征在于：还包括Myl4的上游引物序列：AAGAAACCCGAGCCTAAGAAGG，和Myl4的下游引物序列：TGGGTCAAAGGCAGAGTCCT。

6.如权利要求5所述的化学品胚胎毒性预测模型，其特征在于：还包括cTnT的上游引物序列：CAGAGGAGGCCAACGTAGAAG，cTnT的下游引物序列：CTCCATCGGGGATCTTGGGT，Myh6的上游引物序列：GCCCAGTACCTCCGAAAGTC和Myh6的下游引物序列：GCCTTAACATACTCCTCCTTGTC。

7.如权利要求1-6任一项所述的化学品胚胎毒性预测模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养；

步骤二：小鼠ES的体外扩增培养；

步骤三：小鼠ES的核型分析及性别鉴定；

步骤四：小鼠ES多能性的维持和鉴定；

步骤五：小鼠ES体外诱导分化为心肌细胞；

步骤六：小鼠ES诱导分化的心肌细胞的心肌特异性标志蛋白的免疫化学检测；

步骤七：小鼠ES诱导分化的心肌细胞的表达谱的Real-time PCR检测；

步骤八：模式化合物的选择：选择4种及以上模式化合物使得该模式化合物集合包含强致畸性化合物、弱智畸性化合物、无致畸性化合物以及在雌雄性别中致畸性有所不同的化合物；

步骤九：模式化合物细胞毒性的检测：获得各模式化合物对细胞的半数致死剂量IC₅₀；

步骤十：模式化合物对ES分化能力的抑制效应的检测：获得各模式化合物对ES细胞分化的半数抑制剂量ID₅₀的值；

步骤十一：模式化合物胚胎毒性的评价：通过步骤九得到的IC₅₀和步骤十得到的ID₅₀分析各模式化合物对胚胎毒性的影响程度，建立得到所述化学品胚胎毒性预测模型，从而推广到对其他化学品胚胎毒性的预测；

所述ES包括SP3ES细胞。

8.如权利要求7所述的化学品胚胎毒性预测模型的建立方法，其特征在于，还包括步骤十二：分子观测终点和传统观测终点用于反映模式化合物对ES分化能力的抑制作用下的相关性分析，即采用SPSS 19.0软件的配对散点图功能对分子观测终点和传统观测终点用于测量半数分化抑制能力间的相关性进行分析，同时计算决定系数；当分子观测终点和传统观测终点间决定系数大于0.9时，分子观测终点和传统观测终点高度相关性；以此判断所述化学品胚胎毒性预测模型的准确性和有效性。

9.如权利要求7所述的化学品胚胎毒性预测模型的建立方法，其特征在于，所述步骤六中所述的心肌特异性标志蛋白包括cTnT；所述步骤七中的所述表达谱包括Myh6、Myl4和cTnT基因；所述步骤八中的所述模式化合物包括5-氟尿嘧啶、阿司匹林、吲哚美辛、抗坏血酸、青霉素G；所述步骤四中包括以NIH 3T3成纤维细胞为对照；所述ES还包括R1ES细胞。

10.如权利要求7所述的化学品胚胎毒性预测模型的建立方法，其特征在于，所述步骤九中获得各模式化合物对3T3细胞和ES细胞的半数致死剂量IC₅₀3T3和IC₅₀ES；所述步骤十中获得各模式化合物对ES细胞分化的半数抑制剂量ID₅₀的值；所述步骤十一中通过将所述IC₅₀3T3、IC₅₀ES和ID₅₀数据代入下列判别式中：

(1)5.916lg(IC₅₀3T3)+3.500lg(IC₅₀ES)－5.307[(IC₅₀3T3－ID₅₀)/IC₅₀3T3]－15.27

(2)3.651lg(IC₅₀3T3)+2.394lg(IC₅₀ES)－2.033[(IC₅₀3T3－ID₅₀)/IC₅₀3T3]－6.85

(3)－0.125lg(IC₅₀3T3)－1.917lg(IC₅₀ES)+1.500[(IC₅₀3T3－ID₅₀)/IC₅₀3T3]－2.67

胚胎毒性判断标准为：

若(1)＞(2)且(1)＞(3)，则判断化合物为无发育毒性；

若(2)＞(1)且(2)＞(3)，则判断化合物为弱发育毒性；

若(3)＞(1)且(3)＞(2)，则判断化合物为强发育毒性。