[发明专利]一种化学品胚胎毒性预测模型及其建立方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种化学品胚胎毒性预测模型及其建立方法，尤其涉及一种小鼠胚胎干细胞定向诱导分化为具有搏动能力的心肌细胞，并在所获得的心肌细胞上建立化学品胚胎毒性的识别和预测模型，并应用于新化学品胚胎毒性的预测中。

背景技术

目前，化学品的毒性数据多在实验动物中获得，如急性毒性试验，亚急性毒性试验，慢性毒性试验等。但是，开展动物实验存在几个不容忽视的问题：1.需要大量的财力，2.实验周期长，3.需要大量的实验动物，4.因体内影响因素较多，难以进行代谢和机制研究。出于动物保护原则，Russell和Burch提倡“3R”原则，即减少(Reduction)，优化(Refinement)和替代(Replacement)，无论是从科学角度还是从经济角度，毒理学替代法对外源性化学物的危害评价及管理都有非常重要的意义。

据欧洲化学品管理、评估和限制机构(REACH)估计，接下来的15年中将会有30000种化学品需要进行安全性测试，根据现有的测试指南，将牺牲7百万只动物，其中约64％是用于化学品的生殖和发育毒性评价；每检测2000种新化合物的发育毒性，约需耗资6亿欧元。而新化合物的数目以每年1000种递增，其中90％以上没有安全性评价的数据。在这一过程中，无论是动物的使用情况，还是测试过程中人力、物力、财力的消耗，如此巨大的数字，让人触目惊心。

我国幅员辽阔，人口众多，因此在面临评价化合物暴露导致的健康问题时情况将比其他国家更为复杂。并且由于各地化合物种类、比例不同，在开展流行病学调查的时候重点也不相同，加上工业快速发展、城市化进程加快的同时也带来了新型污染物及其快速扩散的问题。毒理学替代法的应用与推广同样适用于我国的国情。

自1986年欧盟实施动物福利指导原则以来，欧盟大力支持替代法的发展与使用。胚胎干细胞试验(EST)是经过欧洲替代方法研究中心(EURL-ECVAM)验证的一类用于预测化合物潜在胚胎毒性的实验方法。该方法充分利用了胚胎干细胞的分化潜能，设置分化的观察终点，结合细胞的一般毒理学数据，通过判别方程式对化合物的潜在胚胎毒性进行评估和分级，从而实现对化合物的安全性评价，属于一种测试方法的替代体系。借助EST，在诱导的不同阶段或不同的诱导方向进行化学品的暴露，可模拟反应分化过程中化合物对机体发育的影响，在毒性筛选、毒性靶器官确定、毒性作用机制等毒理学研究中具有独特的优势。随着国际上干细胞生物学研究的不断深化，胚胎干细胞模型也得到进一步发展，即利用其分化潜能寻找靶器官或监测分化过程中关键基因的表达，发现化合物对肝脏、肌肉、血管、骨等器官组织的影响，通过选择多个观察终点，可以分别评估化合物对相应器官组织的潜在毒性。整个评估周期在10至21天之间，并且在整个实验过程中都不需要用到活体的动物，节约人力、物力、财力和时间，可重复性强，易于操作，符合国际上化合物毒性评价替代研究的要求，因而引起广泛的关注。

EST适用于从细胞水平分析发育过程，并判断某因素是否具备胚胎毒物或致畸潜能。目前，EST多选择心肌细胞作为分化发育后的衡量指标，其原因有第一、心脏发育始于胚胎发育早期，使得在体外通过诱导胚胎干细胞(简称ES或者ESC)分化为心肌细胞模拟体内的心脏发育过程较易实现；第二、心脏发育是一个高度特化的过程，对发育过程的细微干扰即可导致心脏发育出现异常，因而具备较高的灵敏度；第三、由于ES诱导分化的心肌细胞具有搏动能力，作为观测终点具有良好的可视性。

为了验证EST的准确性，Scholz进行了以下实验：1.受试物对分化的3T3成纤维细胞的细胞毒性效应；2.受试物对未分化的ES细胞的细胞毒性效应；3.受试物对ES细胞向心肌细胞分化的影响。以相应的体内试验资料作为根据，在10种受试物中，100％准确地判断了非胚胎毒性物质，88.9％准确地判断了弱胚胎毒性物质，91.7％准确地判断了强胚胎毒性物质。在此实验数据基础上，结合受试物的体内试验信息，Genschow等建立了判别方程模型，对化合物的胚胎毒性开展三级预测，即判断化合物为无胚胎毒性、低胚胎毒性或者高胚胎毒性。EST具备筛选化合物胚胎毒性的功能，因此被世界各大化学品制造商、药厂等用于对新原料或新药的筛选及胚胎毒性的安全性测试。

国际上许多致力于优化EST的科学家通过大量的研究，提出了EST的标准化操作流程中存在以下两点亟待优化的地方：第一、EST是基于ES细胞系D3建立和推广的，建议同时采用其他ES细胞系建立模型，保证评价结果的准确性；第二、观测心肌细胞的搏动受主观因素影响较大，因此建议以分子生物学指标作为观测终点，以提高准确度。