[发明专利]一种葡萄糖酸杆菌属基因无痕敲除体系及应用

权利要求书

1.一种葡萄糖酸杆菌属的基因无痕敲除体系，其特征在于，包括一株野生型葡萄糖酸杆菌属(Gluconobacter)菌株和一个带有SacB基因、抗生素标记和多克隆位点的重组整合型自杀质粒。

2.根据权利要求1所述葡萄糖酸杆菌属基因无痕敲除体系，其特征在于，所述SacB基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述葡萄糖酸杆菌属基因无痕敲除体系，其特征在于，所述抗生素标记为卡那霉素抗性基因标记。

4.根据权利要求1所述葡萄糖酸杆菌属基因无痕敲除体系，其特征在于，重组整合型自杀质粒的制备方法如下：

(1)构建含SacB基因的克隆质粒pEASY-Blunt-SacB；

(2)取测序正确的克隆质粒pEASY-Blunt-SacB，通过SspI单酶切克隆质粒pEASY-Blunt-SacB和自杀质粒pK18mobGII，回收并连接、转化进E.coli DH5α，筛选获取SacB连接方向正确的阳性克隆，并培养E.coli DH5α，提取整合型质粒，即得所述重组整合型自杀质粒。

5.一种利用权利要求1所述基因无痕敲除体系进行葡萄糖酸杆菌属中基因敲除的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将待敲除目的基因的上、下游片段引入重组整合型自杀质粒的多克隆位点，得到自杀型敲除质粒；

(2)将所得自杀型敲除质粒转化进野生型葡萄糖酸杆菌中，依次进行抗生素抗性筛选和蔗糖筛选，最后采用菌落PCR验证得到目的基因敲除的基因缺陷型菌株。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述葡萄糖酸杆菌为野生型氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)。

7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，目的基因的上、下游片段大小为500-1200bp。

8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，目的基因的上、下游片段大小为800-1000bp。

9.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述抗生素抗性筛选是将转化子涂布于卡那霉素和头孢西丁的甘露醇培养基平板，得到基因组整合型转化子。

10.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述蔗糖筛选是抗生素基因整合转化子经甘露醇培养基试管培养后，划线于含有5～10％蔗糖和头孢西丁的甘露醇培养基平板，得到脱离自杀质粒的突变型菌株。