[发明专利]一种葡萄糖酸杆菌属基因无痕敲除体系及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种葡萄糖酸杆菌属Gluconobacter基因无痕操作的体系，尤其是适用于基因无痕敲除或者无痕整合的体系，属于基因工程技术领域。

背景技术

葡萄糖酸杆菌属(Gluconobacter)为一群极生鞭毛、可运动或无运动性的细菌种群，在分类学地位上属于变形菌门(Proteobacteria)、α-变形菌纲(Alpha-proteobacteria)、红螺菌目(Rhodospirillales)、醋酸菌科(Acetobacteraceae)。其是一种专性好氧的革兰氏阴性菌，对人和动物无病原性，但可引起水果的细菌性腐烂和褐变，因此其常在含糖丰富的环境，如鲜花、水果等。该菌种含有多种膜结合脱氢酶，如D-葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrgenase)、甘油脱氢酶(glycerol dehydrogenase)、D-山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase)等，使得大部分底物能在细胞质膜上被快速氧化并分泌到胞外，这种氧化称为不完全氧化。因此，该菌种广泛应用于维生素C、5-脱氧野尻霉素、D-葡萄糖酸、酮基葡萄糖酸、2-羟丙酮和醋酸等工业化生产，如CN103484418A、CN102041264A、WO2004029262、CN103484417A等，特别的是生物合成维生素前体2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid,2-KLG)的关键菌株，具有非常高的工业应用价值。

2005年Gluconobacter oxydans 621H的基因组序列公布Nat Biotechnol,23(2),195-200，这为基因组学、蛋白组学及代谢组学研究提供了便利，然而目前，针对Gluconobacter的基因工程操作技术还不够成熟。传统的手段都是通过插入抗生素抗性基因，使目的基因失活达到敲除的目的(Appl Microbiol Biotechnol 2005,66:668-674；J Bacteriol 2006,188:7668-7676；Appl Environ Microbiol 2010,76:4369-4376；Appl Environ Microbiol 2009,75:4240-4247；Appl Environ Microbiol 2008,74:5250-5253)，该方法存在明显的不足之处，外源抗性基因的插入不仅会对上下游基因引起极化作用(Prog Biochem Biophys 2009,36:556-565)，更甚的是影响重组宿主菌的生物安全性。另外，现有可用的抗生素基因相对有限，一旦抗性基因整合进基因组，则该抗性基因就无法再次使用，这就限制了该方法的连续使用，特别的是在代谢工程研究中的应用，其常常涉及多功能基因的操作。

目前，有研究报道了一种用于葡萄糖酸杆菌的无抗性基因的敲除的方法，如Appl Microbiol Biotechnol 2013,97:8341-8349；Appl Environ Microbiol 2012,78:6975-6986；J Bacteriol 2013,195:4210-4220及CN103805545A，其依赖于upp基因，一种编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶，能将5-氟尿嘧啶转化为5-氟尿苷一磷酸，进一步转化为5-氟脱氧尿苷单磷酸，而5-氟脱氧尿苷单磷酸是胸苷酸合成酶的不可逆抑制剂，从而导致DNA合成受阻，起到致死作用。具体方法是：首先敲除掉宿主菌的upp基因，得到upp基因缺陷型菌株，使其能在含有5-氟尿嘧啶的培养基上生长；同时构建一个含条件致死功能的upp基因的重组整合质粒，通过质粒与基因组的整合，先后经抗生素抗性和抗5-氟尿嘧啶筛选，获取目的基因缺陷型突变株。该方法的局限性在于首先要获得upp基因缺陷型菌株，缺乏普遍性；而反向筛选物5-氟尿嘧啶本身属于有毒物质，危险等级为Xn，半数致死量(大鼠，经口)230mg/kg，且具有腐蚀性，不适合广泛应用。

发明内容

本发明提供一种葡萄糖酸杆菌属基因无痕操作体系及应用，适用性广、操作安全。

一种葡萄糖酸杆菌属的基因无痕敲除体系，包括一株野生型葡萄糖酸杆菌属(Gluconobacter)菌株和一个带有SacB基因、抗生素标记和多克隆位点的重组整合型自杀质粒。

优选地，所述SacB基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述抗生素标记为卡那霉素抗性基因标记。

优选地，葡萄糖酸杆菌属可以是野生型氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)。