[发明专利]人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法

权利要求书

1.人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)胎盘标本处理，得处理后的胎盘组织，将胎盘组织进行组织消化，得细胞悬液；

(2)不连续Percoll梯度密度分离：在50mL离心管中逐层铺入7个密度的Percoll分离液，每个密度5mL，再缓缓加入5mL细胞悬液，使用水平离心机室温下1200g离心20min，小心弃除离心管20mL刻度以上的液体，收集12.5～20.0mL刻度的细胞层和12.5～7.5mL刻度的液体，分别放入不同离心管里，用D-Hank’s液稀释5倍后，室温下1000g离心15min；

(3)滋养细胞的纯化：用含体积分数为10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12、丙酮酸盐、10毫克/升亚硒酸钠胰岛素、2毫克/升乙醇胺和20毫微克/mL的bFGF配制成悬浮液，将密度梯度离心后的滋养细胞进行重悬，用差速贴壁法去除成纤维细胞后计数；

(4)胎盘间充质干细胞的进一步分离与培养：用含体积分数为10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12、丙酮酸盐、10毫克/升亚硒酸钠胰岛素、2毫克/升乙醇胺和20毫微克/mL的bFGF、增殖促进剂配制成悬浮液，将密度梯度离心后获得的胎盘间充质干细胞进行重悬，在微重力环境下，依次通过电磁场和声波处理间充质干细胞，计数并接种于75mm的培养瓶，放入37℃、二氧化碳浓度为0.5％的CO2培养箱中培养，2d换液1次，细胞生长至90％融合后，消化并计数细胞，按1∶4比例传代，细胞传代后生长速度较快，细胞形态比较均一，变化形态明显的第2天用100ng/ml的BMP4处理，第3天或4用10ng/ml的BMP4处理，第5天用1ng/ml的BMP4处理，到第6天时，用差速贴壁法将未贴壁的上层除掉，然后向培养瓶中补加无血清培养基继续培养，直到传至第九或十代。

2.如权利要求1所述的人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法，其特征在于所述的胎盘标本处理步骤包括：无菌条件下将娩出胎盘剥除羊膜，剪除胎盘母体面2.0～3.0mm组织后，剪下胎盘小叶，称取50g，浸泡于含有抗菌肽的保存液中，所述含有抗菌肽的保存液是将10～100微克/毫升多聚赖氨酸加入到10～100微克/毫升没食子酸酯EGCG中配制而成，浸泡预定时间后，将剪下的胎盘小叶用手术剪剪碎，用生理盐水反复冲洗血污，直至冲洗液接近无色。

3.如权利要求1所述的人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法，其特征在于所述组织消化步骤包括：用15mmol/L三羟甲基氨基甲烷，加入哈特曼-D溶液，调节pH至8.0，作为消化缓冲液，加入终浓度为2.4g/LHyQTase(购于HyClone公司)和300U/mLDNaseI组成的消化液，取消化液320mL，将冲洗后的胎盘组织分多次进行消化，每次在37±0.2℃、180r/min恒温气浴摇床消化2min，消化完毕后，无菌去除HyQTase溶液，用新生牛血清终止消化反应，得到细胞悬液。

4.如权利要求1所述的人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法，其特征在于所述增殖促进剂为凝结的脐带血液的液体成分。

5.如权利要求1所述的人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法，其特征在于所述微重力环境是通过多轴旋转所形成的模拟微重力环境。