[发明专利]人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体是涉及人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法。

背景技术

常规分离方法通常难以获得大量纯度较高的滋养细胞和胎盘间充质干细胞；应用流式细胞仪分选法或磁珠分选法获得的细胞虽然纯度好，但成本很高。

滋养细胞在体外培养和传代比较困难，很多研究者都采用分离细胞后直接处理或干预的方案，因此一次性获得大量的滋养细胞对实验进行是非常有利的。胎盘间充质干细胞在胎盘组织的丰度低，想获得一定数量的原代细胞也需要很多的胎盘组织。

现有技术中，胎盘的细胞成分较复杂，其中所包含的滋养细胞在母胎免疫耐受过程中起重要作用，胎盘间充质干细胞具有多向分化潜能以及抑制淋巴细胞增殖的特性，常规离方法通常难以获得大量且纯度较高的上述两种细胞。

发明内容

本发明解决的技术问题是针对现有技术存在的缺陷，提供一种人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法，可以分离出较高纯度的人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：

人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法，包括以下步骤：

(1)胎盘标本处理，得处理后的胎盘组织，将胎盘组织进行组织消化，得细胞悬液；

(2)不连续Percoll梯度密度分离：在50mL离心管中逐层铺入7个密度的Percoll分离液，每个密度5mL，再缓缓加入5mL细胞悬液，使用水平离心机室温下1200g离心20min，小心弃除离心管20mL刻度以上的液体，收集12.5～20.0mL刻度的细胞层和12.5～7.5mL刻度的液体，在离心管15～20mL刻度处可见明显的白色云雾状细胞层，此处对应的Percoll相对密度为1.046～1.059，是滋养细胞存在的区域；离心管10mL刻度附近可见不明显的细胞层，此处密度为1.072，是淋巴细胞和胎盘间充质干细胞存在的区域，分别放入不同离心管里，用D-Hank’s液稀释5倍后，室温下1000g离心15min；离心管底可见白色细胞团；

(3)滋养细胞的纯化：用含体积分数为10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12、丙酮酸盐、10毫克/升亚硒酸钠胰岛素、2毫克/升乙醇胺和20毫微克/mL的bFGF配制成悬浮液，将密度梯度离心后的滋养细胞进行重悬，用差速贴壁法去除成纤维细胞后计数，获得的滋养细胞量可达(5.48±1.98)×108个；

(4)胎盘间充质干细胞的进一步分离与培养：用含体积分数为10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12、丙酮酸盐、10毫克/升亚硒酸钠胰岛素、2毫克/升乙醇胺和20毫微克/mL的bFGF、增殖促进剂配制成悬浮液，将密度梯度离心后获得的胎盘间充质干细胞进行重悬，在微重力环境下，依次通过电磁场和声波处理间充质干细胞，可以获得具有更小的平均气泡尺寸的间充质干细；计数并接种于75mm的培养瓶，在培养基中补充4mg/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、10ng/mlN-乙酰基-L-半胱氨酸、100ng/ml氯化钙，放入37℃、二氧化碳浓度为0.5％的CO2培养箱中培养，2d换液1次，细胞生长至90％融合后，消化并计数细胞，按1∶4比例传代，细胞传代后生长速度较快，细胞形态比较均一，变化形态明显的第2天用100ng/ml的BMP4处理，第3天或4用10ng/ml的BMP4处理，第5天用1ng/ml的BMP4处理，到第6天时，用差速贴壁法将未贴壁的上层除掉，然后向培养瓶中补加无血清培养基继续培养，传至第8代时细胞开始出现老化现象，细胞增殖缓慢，细胞体积增大，胞浆中出现很多黑色颗粒，此时需要注入一种抗氧化剂，所述抗氧化剂为聚乙二醇-缀合过氧化氢酶(PEG-过氧化氢酶)或N-乙酰半胱氨酸，或使用抗氧化物，所述抗氧化物为1-500μM丙酮酸乙酯(EP)，抑制间充质干细胞的衰老，用于增加干细胞产量，直到传至第九或十代。

进一步地，在上述方案中，所述的胎盘标本处理步骤包括：无菌条件下将娩出胎盘剥除羊膜，剪除胎盘母体面2.0～3.0mm组织后，剪下胎盘小叶，称取50g，浸泡于含有抗菌肽的保存液中，所述含有抗菌肽的保存液是将10～100微克/毫升多聚赖氨酸加入到10～100微克/毫升没食子酸酯EGCG中配制而成，浸泡预定时间后，将剪下的胎盘小叶用手术剪剪碎，用生理盐水反复冲洗血污，直至冲洗液接近无色。