[发明专利]一种用混合模式层析填料制备免疫球蛋白G Fc片段的方法

权利要求书

1.一种用混合模式层析填料制备免疫球蛋白G Fc片段的方法，其特征是包括以下步骤：

(1)采用MEP HyperCel混合模式层析填料处理人血浆

采用MEP HyperCel混合模式层析填料处理人血浆，获得免疫球蛋白IgG，首先使用平衡液A平衡装有MEP HyperCel层析填料的层析柱，平衡至层析柱流出液pH值与平衡液A相同，再取人血浆低速离心后除去悬浮物，用平衡液A稀释至3倍体积后，直接上样于平衡后的层析柱，上样后用平衡液A冲洗层析填料中未结合的成分,然后使用洗脱液A进行洗脱，并收集洗脱组分，洗脱完毕后采用0.1mol/L氢氧化钠对层析柱进行在位清洗，之后再使用平衡液A平衡层析柱，其中所述平衡液A为三羟基氨基甲烷-盐酸或磷酸盐缓冲液，pH值为7～8，浓度不大于0.2mol/L，所述洗脱液A为0.05mol/L的醋酸钠缓冲液，pH值为4.0～5.0；

(2)木瓜蛋白酶水解IgG

更换缓冲液：将洗脱组分置于超滤管中，加入体积等体积的酶解缓冲液进行超滤浓缩，重复5次，收集最后一次超滤组分，完成缓冲液的更换，即将醋酸钠缓冲液更换成酶解缓冲液；其中酶解缓冲液组成为：25mmol/LNaH₂PO₄-50mmol/L NaCl，pH值为7.2，

木瓜蛋白酶水解IgG：在木瓜蛋白酶溶液中，分别加入四乙酸乙二胺和巯基乙醇，使溶液中四乙酸乙二胺和巯基乙醇的终浓度分别为4mmol/L和20mmol/L，并维持15分钟使木瓜蛋白酶充分活化，然后将活化的木瓜蛋白酶加入最后一次超滤组分缓冲液中进行酶切反应，结束后加入过氧化氢终止反应，制成IgG的木瓜蛋白酶解液，过氧化氢在反应体系中的终浓度介于0.8～1％，木瓜蛋白酶与IgG的质量比≥1:20，酶切反应时间大于等于8小时；

(3)采用混合模式层析填料MEP HyperCel处理IgG的木瓜蛋白酶解液

将IgG的木瓜蛋白酶解液离心，除去悬浮物，上样于经平衡的MEP HyperCel层析柱，上样完成后采用平衡液B冲洗，再用洗脱液B洗脱，洗脱组分即为纯化的IgG Fc片段，洗脱结束后用0.1mol/L氢氧化钠溶液清洗层析柱料，所述平衡液B的组成为：25mmol/L Tris-HCl-50mmol/L NaCl pH为7.0±0.4；洗脱液B的组成为：100mmol/L三羟基氨基甲烷-醋酸-50mmol/L NaCl，pH为4.5±0.1。