[发明专利]一种用混合模式层析填料制备免疫球蛋白G Fc片段的方法

说明书

本发明涉及一种从免疫球蛋白G的木瓜蛋白酶解液中纯化Fc片段的方法，属于Fc片段纯化方法技术领域。本发明主要解决现有蛋白A亲和层析存在介质成本昂贵，寿命周期较短，蛋白质类型的配基易脱落，污染待纯化抗体，洗脱条件较苛刻，容易对抗体造成伤害等问题。本发明一种用混合模式层析填料制备免疫球蛋白G Fc片段的方法，包括以下步骤：(1)采用MEP HyperCel混合模式层析填料处理人血浆，(2)木瓜蛋白酶水解IgG，(3)采用混合模式层析填料MEP HyperCel处理IgG的木瓜蛋白酶解液。本发明具有配基稳定、再生容易、可多次重复使用、洗脱条件温和、不易引起产物结构变异、无需后续操作等优点。

技术领域

本发明涉及一种从免疫球蛋白G的木瓜蛋白酶解液中纯化Fc片段的方法，属于Fc片段纯化方法技术领域。

背景技术

免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)是具有抗体活性的血清蛋白，又称为抗体。是体液免疫应答中发挥免疫功能最主要的免疫分子。人血清Ig分为G、M、A、D、E。IgG是血清中主要的抗体成分，占血清总Ig的75％。IgG在机体免疫防护中起着主要的作用，大多数抗菌、抗病毒、抗毒素抗体都属于免疫球蛋白G类抗体。其指标对于诊断某些疾病具有意义。IgG分子量约为150KD，可以由木瓜蛋白酶酶解为分子量为45KD的Fab片段(antigen-bindingfragment)和55KD的Fc片段(fragment crystalline)。Fc片段相对于IgG抗体分子的Fab部分，在序列结构上具有高度的保守性，因此由Fc片段免疫获得的抗体相对于IgG全分子免疫获得的抗体具有更高的专一性。

目前蛋白质纯化采取的技术手段主要有亲和层析、离子交换层析、疏水相互作用层析、盐析沉淀等。IgG及其Fc片段的分离纯化目前主要以Protein A、ProteinG此两种亲和层析介质为主。Protein A是来源于金黄色葡萄球菌的蛋白，其对IgG分子的Fc片段有很强的亲和力和特异性，在生理PH下两者紧密结合，pH降低至3～4时，两者又可解离。然而，实际应用中Protein A亲和层析存在介质成本昂贵，且寿命周期较短；蛋白质类型的配基易脱落，污染待纯化抗体；洗脱条件较苛刻，容易对抗体造成伤害等缺点。

发明内容

本发明主要针对现有蛋白A亲和层析存在介质成本昂贵，寿命周期较短，蛋白质类型的配基易脱落，污染待纯化抗体，洗脱条件较苛刻，容易对抗体造成伤害等问题，提供一种用混合模式层析填料制备免疫球蛋白G Fc片段的方法。

本发明为解决上述问题而采取的技术方案为：

一种用混合模式层析填料制备免疫球蛋白G Fc片段的方法，包括以下步骤：

(1)采用MEP HyperCel混合模式层析填料处理人血浆

采用MEP HyperCel混合模式层析填料处理人血浆，获得免疫球蛋白IgG，首先使用平衡液A平衡装有MEP HyperCel层析填料的层析柱，平衡至层析柱流出液pH值与平衡液A相同，再取人血浆低速离心后除去悬浮物，用平衡液A稀释至3倍体积后，直接上样于平衡后的层析柱，上样后用平衡液A冲洗层析填料中未结合的成分,然后使用洗脱液A进行洗脱，并收集洗脱组分，洗脱完毕后采用0.1mol/L氢氧化钠对层析柱进行在位清洗，之后再使用平衡液A平衡层析柱，其中所述平衡液A为三羟基氨基甲烷-盐酸或磷酸盐缓冲液，pH值为7～8，浓度不大于0.2mol/L，所述洗脱液A为0.05mol/L的醋酸钠缓冲液，pH值为4.0～5.0；

(2)木瓜蛋白酶水解IgG

更换缓冲液：将洗脱组分置于超滤管中，加入体积等体积的酶解缓冲液进行超滤浓缩，重复5次，收集最后一次超滤组分，完成缓冲液的更换，即将醋酸钠缓冲液更换成酶解缓冲液。其中酶解缓冲液组成为：25mmol/LNaH₂PO₄-50mmol/L NaCl，pH值为7.2，