[发明专利]一种建立农杆菌介导东农冬麦1号成熟胚遗传转化的方法

权利要求书

1.一种建立农杆菌介导东农冬麦1号成熟胚遗传转化的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、挑选当年籽粒饱满的东农冬麦1号成熟种子，消毒，灭菌，清洗后，置于黑暗培养箱的无菌水中过夜；然后在无菌状态下，将过夜后的种子无菌干燥后，采用胚切伤略带胚乳法进行取胚，将胚的盾片朝上接种在诱导培养基中培养得到胚性愈伤组织；再将胚性愈伤组织置于预培养培养基中进行预培养得到预培养愈伤组织；

S2、取农杆菌在YEP培养基划线培养；接着挑取培养得到的农杆菌单菌落接种在液体YEB培养基中培养至对数期，离心得到菌液；将菌液加入侵染培养基中重悬得到混合物料；

S3、将预培养愈伤组织浸入混合物料中侵染，吸取多余菌液，无菌干燥，然后置于含有两层无菌滤纸的培养皿中进行共培养3～5d；再置于恢复培养基上进行恢复培养2周；接着置于分化筛选培养基上进行抗性筛选4周得到再生植株，其中每隔2周更换1次分化筛选培养基；

S4、将再生植株置于生根培养基中进行壮苗生根培养18～22d后，打开瓶口炼苗2～4d，然后将植株移栽到花盆中培养。

2.根据权利要求1所述建立农杆菌介导东农冬麦1号成熟胚遗传转化的方法，其特征在于，S1中，黑暗培养箱中温度为25±1℃；优选地，S1中，无菌干燥的具体操作为将浸泡过夜后的种子置于无菌滤纸上以吸干过夜后的种子表面水分；优选地，S1中，取胚的过程中在超净工作台中进行。

3.根据权利要求1或2所述建立农杆菌介导东农冬麦1号成熟胚遗传转化的方法，其特征在于，S1中，诱导培养基包括：MS培养基、450～550mg/L酪蛋白、80～120mg/L谷氨酰胺、0.05～0.15mg/LNAA、0.2～0.4g/L肌醇、0.8～1.2g/L脯氨酸、0.4～0.6mg/LABA、0.9～1.1mg/L2,4-D、28～32g/L蔗糖和7～9g/L琼脂。

4.根据权利要求1-3任一项所述建立农杆菌介导东农冬麦1号成熟胚遗传转化的方法，其特征在于，S1中，预培养培养基包括：MS培养基、450～550mg/L酪蛋白、80～120mg/L谷氨酰胺、0.05～0.15mg/LNAA、0.2～0.4g/L肌醇、0.8～1.2g/L脯氨酸、0.4～0.6mg/LABA、1.9～2.1mg/L2,4-D、28～32g/L蔗糖和7～9g/L琼脂；优选地，S1中，预培养培养基的pH值为5.5～6；优选地，S1中，预培养的时间为6～18d，优选为18d。

5.根据权利要求1-4任一项所述建立农杆菌介导东农冬麦1号成熟胚遗传转化的方法，其特征在于，S2中，液体YEB培养基包括：4～6g/L蛋白胨、0.8～1.2g/L酵母提取物、4～6g/L牛肉膏、0.3～0.7g/LMgSO₄·7H₂O、45～55mg/L利福平、45～55mg/L卡那霉素、45～55mg/L链霉素、4～6g/L蔗糖、12～18g/L琼脂；优选地，S2中，液体YEB培养基pH值为6.5～7.5。

6.根据权利要求1-5任一项所述建立农杆菌介导东农冬麦1号成熟胚遗传转化的方法，其特征在于，S2中，菌液浓度为OD₆₀₀=0.5～1.0，优选为OD₆₀₀=0.8；优选地，S2中，侵染培养基包括：MS培养基、180～220μmol/LAS、1.9～2.0g/LMES、28～32g/L蔗糖；优选地，S2中，侵染培养基的pH值为5～5.5。

7.根据权利要求1-6任一项所述建立农杆菌介导东农冬麦1号成熟胚遗传转化的方法，其特征在于，S3中，侵染的时间为1～5h，优选为3h；优选地，S3中，共培养的时间为5d。

8.根据权利要求1-7任一项所述建立农杆菌介导东农冬麦1号成熟胚遗传转化的方法，其特征在于，S3中，恢复培养基包括：MS培养基、450～550mg/L酪蛋白、80～120mg/L谷氨酰胺、0.05～0.15mg/LNAA、0.2～0.4g/L肌醇、0.8～1.2g/L脯氨酸、0.4～0.6mg/LABA、1.9～2.1mg/L2,4-D、240～260mg/L头孢霉素、230～270mg/L羧苄青霉素、28～32g/L蔗糖和7～9g/L琼脂；优选地，S3中，恢复培养基的pH值为5～5.5。