[发明专利]一种建立农杆菌介导东农冬麦1号成熟胚遗传转化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及农杆菌介导的遗传转化技术领域，尤其涉及一种建立农杆菌介导东农冬麦1号成熟胚遗传转化的方法。

背景技术

目前，植物转基因技术研究主要采用的方法是农杆菌介导的遗传转化法，研究发现不同的植物应用此种方法获得的转化效率差异也很大。双子叶植物是农杆菌的天然宿主，1983年Zambryski等应用农杆菌介导法，将T～DNA转入烟草细胞，获得第一株转基因植物。在双子叶植物上取得了巨大成功，研究者们继续探索单子叶植物的转化。直到20世界90年代才取得了一系列进展。水稻是最早应用农杆菌介导法进行遗传转化，并成功获得转基因植株的禾本科植物，1994年Hiei等利用农杆菌介导法成功将GUS基因导入水稻基因组中，转化率高达28.6%，其研究成果突破了农杆菌不能转化单子叶植物的禁区。Ishida等以玉米未成熟的胚为转化受体，利用农杆菌介导法进行转化，得到转化率为5～30%。Tingay等利用农杆菌侵染大麦，获得转化率为4.2%。农杆菌介导的遗传转化法在小麦上的应用，直到1997年才取得成功，Cheng等用农杆菌侵染小麦幼胚，成功得到转基因小麦植株。农杆菌转化方法具有可插入大片度DNA、插入基因拷贝数低、转化频率高、表达效果好、遗传稳定等优点，是目前应用最广泛的植物转化的方法。

双子叶植物富含酚类物质能够作为诱导信号，对农杆菌较为敏感，如番茄、马铃薯和胡萝卜等。而禾本科作物中缺少这类物质，即使产生了其含量也不高。因此，在国际权威杂志上，瑞士科学家Potrykus发表了悲观的论点包括：1、大多数单子叶植物上不包含农杆菌附着位点；2、大多数单子叶植物损伤部位的细胞容易造成木质化或最终导致死亡；3、大多数单子叶植物缺少与Vir区基因活化诱导相关的因子。因此认为单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，农杆菌介导转化单子叶植物几乎不能实现。由于小麦的基因组庞大，遗传背景复杂且转基因起步较晚等因素，因此农杆菌介导法在小麦的遗传转化上的应用进展缓慢。

1988年Woolston等用农杆菌转化小麦细胞，但一直没有得到转基因植株。最终在1997年Cheng等以刚剥离的小麦幼胚为受体材料，利用农杆菌介导法第一次成功获得了转基因的小麦植株。1999年夏光敏等应用携带nptII基因的农杆菌Agl1转化7种小麦品种，经过再生植株分子鉴定，证明再生植株为转基因的小麦植株。Wu等人应用AGL1菌株转化小麦幼胚，获得了能稳定遗传的转基因植株，转化率高达3.3%。此后，农杆菌转化小麦的方法日趋完善。

而东农冬麦1号是目前黑龙江省高寒地区唯一可以安全越冬的冬小麦品种，可耐受～30℃低温，返青率在85%左右，利用农杆菌介导的遗传转化技术对小麦进行遗传改良具有重要意义。

发明内容

本发明提出了一种建立农杆菌介导东农冬麦1号成熟胚遗传转化的方法，以东农冬麦1号的成熟胚为试验材料，采用农杆菌转化，从而建立了农杆菌介导的东农冬麦1号成熟胚遗传转化体，为其抗性和品质等基因工程改良奠定研究基础。

本发明提出的一种建立农杆菌介导东农冬麦1号成熟胚遗传转化的方法，包括如下步骤：

S1、挑选当年籽粒饱满的东农冬麦1号成熟种子，消毒，灭菌，清洗后，置于黑暗培养箱的无菌水中过夜；然后在无菌状态下，将过夜后的种子无菌干燥后，采用胚切伤略带胚乳法进行取胚，将胚的盾片朝上接种在诱导培养基中培养得到胚性愈伤组织；再将胚性愈伤组织置于预培养培养基中进行预培养得到预培养愈伤组织；

S2、取农杆菌在YEP培养基划线培养；接着挑取培养得到的农杆菌单菌落接种在液体YEB培养基中培养至对数期，离心得到菌液；将菌液加入侵染培养基中重悬得到混合物料；

S3、将预培养愈伤组织浸入混合物料中侵染，吸取多余菌液，无菌干燥，然后置于含有两层无菌滤纸的培养皿中进行共培养3～5d；再置于恢复培养基上进行恢复培养2周；接着置于分化筛选培养基上进行抗性筛选4周得到再生植株，其中每隔2周更换1次分化筛选培养基；

S4、将再生植株置于生根培养基中进行壮苗生根培养18～22d后，打开瓶口炼苗2～4d，然后将植株移栽到花盆中培养。

优选地，S1中，黑暗培养箱中温度为25±1℃。

优选地，S1中，无菌干燥的具体操作为将浸泡过夜后的种子置于无菌滤纸上以吸干过夜后的种子表面水分。

优选地，S1中，取胚的过程中在超净工作台中进行。