[发明专利]植物多基因敲除载体的构建及应用

权利要求书

1.植物多基因敲除载体的构建方法，其特征是包括如下步骤：

1)、双元表达载体pC1300-Cas9的构建：

以双元载体pCAMBIA1300为骨架载体，融合了2×CaMV 35S启动子，经密码子优化的Cas9核酸序列，及CaMV终止子；在2×CaMV 35S启动子前，设计了KpnI和BamHI这两个单酶切位点，用于连接单个或多个gRNA；

2)、中间载体SK-gRNA的构建：

以pBlueScript SK(+)为骨架载体，融合了水稻的U3启动子/拟南芥的U6启动子，gRNA骨架序列及poly-T尾巴，用于敲除单子叶植物基因/敲除双子叶植物基因；

在U3启动子前设计了BglII、NheI、SalI三个单酶切位点，poly-T尾巴之后设计了XhoI、XbaI、BamHI、KpnI单酶切位点；其中，BglII和BamHI，NheI和XbaI，SalI和XhoI是同尾酶；

3)、单个目的gRNA的构建：

在目标基因的基因组序列上找序列为目标序列；

设计两个互补DNA序列分别为：在正向序列前加GGCA，在反向互补序列前加AAAC；

SK-gRNA上有两个AarI酶切位点，用AarI酶切后，形成带有粘性末端的载体；将设计的靶序列正向及反向引物变性退火后，T4连接酶连入SK-gRNA，形成单个目的gRNA；

4)、多个gRNA的串联及最终双元表达载体的构建：

①、单个gRNA用KpnI和BglII双酶切SK-gRNA提供片段，连入载体pC1300-Cas9的KpnI和BamHI识别位点间，得到双元表达载体pC1300-Cas9-gRNA；

②、4个之内gRNA的一步法快速连接：

利用BglII和BamHI，NheI和XbaI，SalI和XhoI是同尾酶的属性，作为载体的用KpnI和XhoI进行酶切；提供片段的分别用SalI和XbaI，NheI和BamHI，BglII和KpnI进行酶切，进行4个之内gRNA的一步法快速聚合；最终将聚合好的片段用KpnI和BglII进行酶切并回收片段，连接到pC1300-Cas9的KpnI和BamHI位点间，构建最终双元表达载体，用于转基因制备植物多突变体。

2.根据权利要求1所述的植物多基因敲除载体的构建方法，其特征是：双元表达载体pC1300-Cas9-gRNA¹-gRNA²gRNA³-gRNA⁴，1、2、3、4代表不同的敲除位点。