[发明专利]植物多基因敲除载体的构建及应用

说明书

本发明公开了一种植物多基因敲除载体的构建及应用，包括如下步骤：1)、双元表达载体pC1300‑Cas9的构建；2)、中间载体SK‑gRNA的构建；3)、单个目的gRNA的构建；4)、多个gRNA的串联及最终双元表达载体的构建。本发明利用同尾酶连接的方法将多个gRNA序列连接至已有Cas9序列的双元表达载体上，进而通过农杆菌侵染的转基因技术获得植物多突变体。利用这种同尾酶连接的构建策略，可以组合多个gRNA，通过一次转基因就可获得植物多突变体，从而建立了一种高效、便捷制备植物多突变体的方法。

技术领域

本发明属于生物技术中利用基因工程方法载体构建的技术领域。

背景技术

多突变体在植物基础功能研究及作物育种中有着重要意义。传统获得多突变体的方法是通过单突变体间的相互杂交、子代分离来完成。但是此方法存在以下问题：1、不一定有所需的单突变体；2、若几个基因间存在紧密连锁，则几乎无法获得多突变体；3、整个过程耗时耗力。

近年来，利用改造后的Type II型CRISPR-Cas9系统，在多个物种中成功实现了基因组的定点修饰，证明CRISPR-Cas9是编辑基因组简单、高效且应用广泛的工具。该系统主要利用内切酶Cas9及定位的向导RNA(gRNA)分子，对基因组中特定的DNA序列进行精细改造，在特定的位置敲除或者插入基因。动物中，通过直接注射Cas9及各gRNA的转录本，就可以同时敲除多个基因，获得多突变体。与动物不同，在植物中，获得稳定的多突变体植株需要用转基因技术将Cas9及多个gRNA功能元件导入来发挥功能。其中转基因过程需要先将带功能元件的双元载体转化农杆菌，再通过农杆菌转染植物，将双元载体的LB和RB之间的片段融合进宿主的基因组上。因此，如何将多个gRNA元件及Cas9序列整合在一个双元载体上，是植物中实现多基因同时敲除的关键。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种植物多基因敲除载体的构建及应用；本发明利用同尾酶连接的方法将多个gRNA序列连接至已有Cas9序列的双元表达载体上，进而通过农杆菌侵染的转基因技术获得植物多突变体。利用这种同尾酶连接的构建策略，可以组合多个gRNA，通过一次转基因就可获得植物多突变体，从而建立了一种高效、便捷制备植物多突变体的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供的双元载体及中间载体序列及构建方法如下：

1)、双元表达载体pC1300-Cas9的构建：

该载体以双元载体pCAMBIA1300为骨架载体，融合了2×CaMV 35S启动子，经密码子优化的Cas9核酸序列，及CaMV终止子。在2×CaMV 35S启动子前，设计了KpnI和BamHI这两个单酶切位点，用于连接单个或多个gRNA；结构如图1所示。

2)、中间载体SK-gRNA的构建：

该载体以pBlueScript(SK+)为骨架载体，融合了水稻的U3启动子/拟南芥的U6启动子，gRNA骨架序列及poly-T尾巴(终止子)，用于敲除单子叶植物基因/敲除双子叶植物基因；

备注说明：若是用于敲除双子叶植物基因，可将水稻的U3启动子替换为拟南芥的U6启动子；

在U3启动子前设计了BglII、NheI、SalI三个单酶切位点，poly-T尾巴之后设计了XhoI、XbaI、BamHI、KpnI单酶切位点。其中，BglII和BamHI，NheI和XbaI，SalI和XhoI是同尾酶；结构如图2所示。

3)、单个目的gRNA的构建：

在目标基因的基因组序列上找序列为目标序列(单下划线表示靶序列，双下划线表示PAM序列,↓表示CAS9蛋白拟切割突变位点，在PAM的前3个碱基处。)设计两个互补DNA序列分别为：在正向序列前加GGCA，在反向互补序列前加AAAC；