[发明专利]一步放大法荧光检测汞离子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一步放大法荧光检测汞离子的方法，属于检测用荧光技术领域。

背景技术

汞及其化合物对人体健康存在多种危害，若存在于天然水体中，则会对大范围的人群造成威胁。它能够在生物体中积累，通过生物链转移到人体内，人体内积累的微量汞，人体内积累的微量汞无法通过自身代谢进行排泄，将直接导致心脏、肝、甲状腺疾病，引起神经系统紊乱，慢性汞中毒，甚至引发恶性肿瘤的形成。

溶解态的汞离子往往具有较高的化学活性，是排入天然水体中汞污染物的主要存在形式，其化合物具有较高的水溶性，也是各种汞形态转化的枢纽。因此，确立一个灵敏的高选择性的方法诊断和在水样分析中检测汞离子的含量是至关重要的。检测汞离子的方法主要有分光光度法、原子发射光谱法、原子吸收光谱法等，然后这些方法存在仪器昂贵、分析周期长、样品预处理复杂等缺点,难以适应汞离子检测的方便、快捷、灵敏度等方面的需要。

发明内容

为了解决以上问题，分子生物学技术的发展为汞离子的特异性检测提供了有利条件。本发明基于汞离子可以稳定DNA中T-T错配的原理实现汞离子的检测，基本原理是：汞离子的存在可以稳定ss-DNA序列中的T-T错配，使ss-DNA形成相对稳定的双链结构。而汞离子不存在则无法形成双链结构。

本发明是通过以下步骤得到的：

本发明中一共用到三条链：两条probe链：probe1和probe2，一条发夹链：HAP。两条probe链的一端分别修饰有poly-T结构，用来与目标物汞离子结合；发夹上设置一个酶切位点，发夹两端修饰有荧光基团和猝灭基团。

Probe1：5’-CTT CTT CTT CTT CTTGAT GTT GA-3’（SEQ ID NO:1）；

Probe2：5’- GCT GAG GA TTG TTG TTG TTG TTG-3’（SEQ ID NO:2）；

HAP：5’-GGG CCT CAT TTT TTT TTC AAC ATC CCT CAG CGC TGA GGC CC-3’（SEQ ID NO:3）。

其中Probe1与Probe2中画横线部分的T之间可特异性结合汞离子，从而形成“T-Hg²⁺-T”结构。HAP的3’端修饰FAM发光基团，5’端修饰Dabcyl猝灭基团，没有目标物汞离子时，发夹未被打开，猝灭基团Dabcyl将发光基团FAM猝灭；目标物存在时，发夹被打开，发光基团FAM发光，可用荧光仪检测荧光强度。本文中用到了一种酶： Nt.BbvCI。这是一种限制性内切酶，它识别双链，但只在一条链上进行切割。对单链没有切割。

本发明中汞离子的检测是用荧光仪实现的，通过一步循环的方式来实现信号放大，从而实现汞离子的高灵敏快速检测，并具有良好的特异性。

均相中发生的反应主要有：在有目标物存在的情况下, Probe1与Probe2中T碱基之间会由目标物连接形成“T-Hg²⁺-T”结构，从而使Probe1与Probe2的poly-T部分固定到一起，剩余的部分序列由于拉近了距离，可以与HAP作用形成稳定的结构。此时在内切酶Nt. BbvCI的作用下，将链按照酶切位点切开掉下，发夹打开，猝灭基团与发光基团分离，产生荧光。同时释放游离态的目标物，可再次被利用，从而实现循环放大，即目标物诱导的Probe1循环放大。

在均相反应中，循环放大的反应条件为37℃，反应时间是2h。

所述的制备方法：Probe1：Probe2：HAP 物质量比为1：1：50。

所述的制备方法均相部分，是通过以下步骤得到的：

（1）在200μl离心管中依次放入8μl H₂O；0.5μM，2μl Probe1链,；0.5μM，2μl Probe2链；10μM，5μl HAP链；Nt.BbvCI的buffer 2μl，Nt.BbvCI酶100U/ml 1μl，制成20μl均相体系；在振荡器上振荡30s，混合均匀。

（2）然后将混匀的混合液放入37℃的恒温箱中孵育2h。

所述的制备方法检测方法，是通过以下步骤得到的：

(1) 向混合液中加入180μlH₂O溶液，混合均匀，形成200μl体系，将其全部置入荧光杯中，放入荧光仪；