[发明专利]一种淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种重组载体，其特征在于，在PHT43质粒的BamHI酶切位点前通过连续三次重叠PCR方式将Pgrac启动子替换成α-淀粉酶启动子PamyQ，然后在BamHI酶切位点后插入麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶基因；

所述的α-淀粉酶启动子PamyQ核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.权利要求1所述重组质粒载体的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（i）以穿梭质粒PHT43为模板，进行PCR扩增，得到PHT片段；

所述的PCR引物序列如下：

PHT-up:5’-ACTCAAACATCAAATCTTACAAA-3’

PHT-down:5’-CTTTTCGTATGTGCGGGGCGTGATAAGATAAAAAATTTTTCACGCTTACATCAT-3’

所述的PCR扩增体系为50μl：

2×Taq PCR MasterMix 25μl，10μmol/L引物PHT-up 2.5μl，10μmol/L引物PHT-down 2.5μl，模板 2.5μl，用ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

（ii）提取 B. amyloliquefaciens菌体的DNA，以DNA为模板，进行PCR扩增，得到PamyQ片段；

所述的PCR引物序列如下:

PamyQ-up:5’-TTTTATCTTATCACGCCCCGCACATACGAA-3’

PamyQ-down:5’-TTCCTCCTTTAATTGGGAAGCACAAGTCTGAACGAAA-3’

所述的PCR扩增体系为50μl：

2×Taq PCR MasterMix 25μl，10μmol/L引物PamyQ-up 2.5μl，10μmol/L引物PamyQ-down 2.5μl，模板 2.5μl，用ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，63℃退火30sec，72℃延伸40sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

（iii）以穿梭质粒PHT43为模板，进行PCR扩增，得到SamyQ片段；

所述的PCR引物序列如下:

SamyQ-up:5’-GTGAGCGGATAACAATTCCCAATTAAAGGAGGAAGG-3’

SamyQ-down:5’-GGATCCTACGGCTGATGTTTTTGT-3’

所述的PCR扩增体系为50μl：

2×Taq PCR MasterMix 25μl，10μmol/L引物SamyQ-up 2.5μl，10μmol/L引物SamyQ-down 2.5μl，模板 2.5μl，用ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

（iv）将步骤（i）制得的PHT片段与步骤（ii）制得的PamyQ片段进行重叠PCR，制得PHT-PamyQ片段；

所述的重叠PCR的初次扩增体系为25μl：

PHT片段4μl； PamyQ片段4μl； 2×Taq PCR MasterMix 12.5μl； ddH₂O 4.5μl；

所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，63℃退火30sec，72℃延伸30sec，5个循环；72℃延伸2min；

所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：

上游引物PHT-up 2μl；下游引物PamyQ-down 2μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH₂O 8.5μl；

所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，63℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

（v）将步骤（ii）制得的PamyQ片段与步骤（iii）制得的SamyQ片段进行重叠PCR，制得PamyQ-SamyQ片段；

所述的重叠PCR的初次扩增体系为25μl：

PamyQ片段4μl；SamyQ片段4μl； 2×Taq PCR MasterMix 12.5μl； ddH₂O 4.5μl；

所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，5个循环；72℃延伸2min；

所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：

上游引物PamyQ-up 2μl；下游引物SamyQ-down 2μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH₂O 8.5μl；

所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

（vi）将步骤（iv）制得的PHT-PamyQ片段与步骤（v）制得的PamyQ-SamyQ片段进行重叠PCR，制得PHT-PamyQ-SamyQ片段；

所述的重叠PCR的初次扩增体系为25μl：

PHT-PamyQ片段4μl；PamyQ-SamyQ片段4μl； 2×Taq PCR MasterMix 12.5μl； ddH₂O 4.5μl；

所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸30sec，5个循环；72℃延伸2min；

所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：

上游引物PHT-up 2μl；下游引物SamyQ-down 2μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH₂O 8.5μl；

所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

（vii）将步骤（vi）制得的PHT-PamyQ-SamyQ片段连接到pTOPO-T vector上，制得pTOPO-T-PHT-PamyQ-SamyQ；然后用限制性内切酶KpnI和BamHI对pTOPO-T-PHT-PamyQ-SamyQ和PHT43进行双酶切，然后采用T4连接酶连接，制得重组质粒PamyQ-PHT43；

（viii）以Arthrobacter sp.L77基因组DNA为模板，分别设计扩增麦芽寡糖基海藻糖合成酶TreY的引物F1和R1、扩增麦芽寡糖基海藻糖水解酶TreZ 的引物F2和R2；

F1:5’-GGATCCGTGTTGACACCGAAATCGACCTACC-3’

R15’-CCTCGGGGGTGAACGTGC-3’

F2:5’-ATGAGTTCGCCATTCGAGGT-3’

R2:5’-GACGTCGTCGAGCAGGTGGATGGAGG-3’

以Arthrobacter sp.L77基因组为模板，F1和R1为引物，通过PCR过程获得产物TreY；

所述PCR体系为50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl；上游引物F1 2.5μl；下游引物R1 2.5μl；模板 2.5μl；ddH₂O 17.5μl；

所述PCR程序如下：

95℃变性5min；95℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸2.5min，共30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

（ix）以Arthrobacter sp.L77基因组为模板，F2和R2为引物，通过PCR过程获得产物TreZ;

所述PCR体系为50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl；上游引物F1 2.5μl；下游引物R1 2.5μl；模板 2.5μl；ddH₂O 17.5μl；

所述PCR程序如下：

95℃变性5min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

（x）将获得的产物1和产物2通过重叠PCR方法实现两基因间的拼接，得到产物TreY-TreZ；

所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸2.5min，5个循环；

所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：

上游引物F1 2μl；下游引物R2 2μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH₂O 8.5μl；

所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

（xi）将TreY-TreZ基因片段连接至pZERO-Blunt载体上，制得重组质粒pZERO-TreY-TreZ；用限制性内切酶BamHI和AatII对重组质粒pZERO-TreY-TreZ和步骤（vii）制得的重组质粒PamyQ-PHT43进行双酶切，用T4连接酶进行连接，制得重组质粒PamyQ-PHT43-TreY-TreZ。