[发明专利]一种淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌及其制备方法与应用，特别涉及一种淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶及制造海藻糖的方法，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

海藻糖是一种普遍存在的非还原性双糖，由葡萄糖通过α-1,1糖苷键连接，其中α,α-1,1-海藻糖目前已被分离，并被发现广泛存在于植物、动物及微生物中。天然的海藻糖对生物体或生物大分子具有较好的且非特异性的保护作用，可以使得具备海藻糖的生物体能够度过饥饿、干燥、低温、高温、辐射等恶劣环境。随着对海藻糖认知程度的增加，海藻糖在各方面的应用不断得到拓展，在医药、食品、农业等领域得到广泛推广。

目前海藻糖的生产工艺主要有三种：

(1)提取法

提取法主要通过培养海藻糖含量较高天然生物来获取，目前主要的提取对象为酵母(海藻糖含量约占酵母干重的15％)，但由于海藻糖属于酵母内容物，提取时需要进行复制的破壁及分离提取工艺，因此目前逐渐被酶法制备海藻糖法取代。

(2)单酶法

单酶法在1995年由日本Nishimoto等人首次提出，即采用海藻糖合酶转化麦芽糖生产海藻糖的工艺。海藻糖合酶能够将α,α-1,4-糖苷键连接的麦芽糖直接转化为α,α-1,1-糖苷键连接的海藻糖，该转化反应不需要磷酸盐的存在，不需要消耗高能物质，但该方法所采用的酶热稳定性一般较低，且转化率多为60％左右，另外由于该酶同时具有轻微的水解活性，因此单酶法转化过程中还会产生少量副产物的葡萄糖。

(3)双酶法

双酶法在1991年由Lama等人首次报道，即采用麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)两种酶利用淀粉为底物生产海藻糖的方法。该方法中第一种酶用来催化聚合度(DP)大于3的麦芽糊精，转化其还原端的α-1,4连接键生成α-1,1连接键。第二种酶专一性催化水解α-1,4键生成的α-1,1键海藻糖和低分子量的麦芽低聚糖。目前双酶法多数以还原性淀粉为原料，转化率多为70-80％左右，因此较单酶法相比更为经济，除能够生产海藻糖之外，还可以同时产生具有较高附加值的麦芽三糖，因此该工艺路线已被用于工业化生产。

虽然双酶法具有以上诸多优点，但依然存在不足之处：双酶法转化所用两种酶需要分别进行发酵及纯化才能获取，因此酶的生产成本明显高于单酶法。

枯草芽孢杆菌启动子是实现基因高效表达的关键元件之一。近年来，在启动子的研究方面开展了大量的工作并取得了长足的进展，克隆获得了一批可以应用于枯草芽孢杆菌的启动子。但是，枯草芽孢杆菌的现有启动子在数量、表达量和调控方式等方面存在着诸多问题。需要进一步研究和完善，获得更多表达强度高，诱导调控方便的启动子元件。

对于来自于解淀粉芽孢杆菌的PamyQ启动子来说，用淀粉诱导目的蛋白产生，该淀粉诱导物即能够诱导目的蛋白产生，反过来得到的目的蛋白酶以淀粉为底物直接转化为海藻糖，增加了海藻糖合成的转化率，对于制造海藻糖来说具有重要意义。同时PamyQ系统的诱导物淀粉相对于IPTG和木糖来说，价格便宜，成本低，且对细菌本身无毒性，因此在工业上很有实用价值。

发明内容

本发明主要针对现有技术的不足，提供一种淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌及其制备方法与应用。

本发明技术方案如下：

一种重组载体，其特征在于，在PHT43质粒的BamHI酶切位点前通过连续三次重叠PCR方式将Pgrac启动子替换成α-淀粉酶启动子PamyQ，然后在BamHI酶切位点后插入麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶基因；

所述的α-淀粉酶启动子PamyQ核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

上述重组质粒载体的制备方法，步骤如下：

(i)以穿梭质粒PHT43为模板，进行PCR扩增，得到PHT片段；

所述的PCR引物序列如下：

PHT-up:5’-ACTCAAACATCAAATCTTACAAA-3’

PHT-down:5’-CTTTTCGTATGTGCGGGGCGTGATAAGATAAAAAATTTTTCACGCTTACATCAT-3’