[发明专利]一种蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶及基因和应用

权利要求书

1.一种蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶的基因，其核苷酸序列如NO.1所示。

2.一种蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶，其特征在于，由权利要求1所述基因编码的蛋白质。

3.含有权利要求1所述蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶基因的重组质粒。

4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，该重组质粒中含组氨酸标签。

5.一种蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以NCBI中蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶编码基因为模板，进行上下游引物设计，设计的酶切位点为NcoI、SalI；

(2)提取蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)LJ01的DNA，并以此为模板，通过PCR技术扩增蜡样芽孢杆菌LJ01亚硝酸盐还原酶的基因片段；所述蜡样芽孢杆菌LJ01的保藏编号为CGMCCNO.9360；

(3)利用NcoI、SalI工具酶将扩增片段和质粒pET-32a(+)于37℃下分别切成具有两个粘性末端的片段；采用回收试剂盒回收以上两个片段，并用T4DNA连接酶连接，再转入重组大肠杆菌中，利用抗生素氨苄青霉素进行筛选即获得阳性工程菌；

(4)将上述工程菌经诱导表达，采用亲和层析法纯化，即得到蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶。

6.根据权利5所述的方法，其特征在于，所述上游引物为5’

-GATGCCATGGATGAGTTATGAAAAAGTAT-3’(NcoI)，下游引物为5’

-ACGCGTCGACCTAAGACGCTATTACTTCT-3’(SalI)。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述诱导表达为加入诱导剂IPTG进行诱导，且诱导浓度为0.1～1.0mmol/L。

8.权利要求2所述蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶在降解亚硝酸盐中的应用，其特征在于，在降解过程中需加入电子供体蛋白。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的电子供体蛋白为细胞色素c或从蜡样芽孢杆菌LJ01中提取得到的电子供体蛋白，其添加量为亚硝酸盐还原酶的1/5～1/15。