[发明专利]一种蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶及基因和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种含有蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶基因的克隆表达以及通过大量表达以及高效亲和层析纯化方法得到纯度较高的亚硝酸盐还原酶(NiR)，从而对重组蛋白的性质进行研究。

背景技术

亚硝酸盐是一种潜在的致癌物质，主要原因有2个：(1)大量摄入亚硝酸盐对人体有害，亚硝酸盐的急性中毒作用是导致高铁血红蛋白症(Methemoglobin)，可产生常见的亚硝酸盐急性中毒症状，主要表现为组织缺氧、紫绀，伴随口唇、指甲和皮肤的颜色改变等现象；(2)亚硝酸盐还会造成人体或动物的慢性危害，亚硝酸盐在适宜的条件下，可与食品中蛋白质的分解产物胺进行反应，生成N-亚硝基化合物，目前已经合成该类化合物有100多种，已经证实其中约80％对动物有强致癌性，可诱发大肠、胃、肝、食道等器官的癌症。为预防亚硝酸盐的急性和慢性危害，探索降解食品中潜在致癌物亚硝酸盐的方法和机制，非常必要。NiR是脱氮过程中的第一限速酶，催化亚硝酸盐降解为一氧化氮，大部分反硝化细菌中都存在NiR，使得其可以高效快速有效降解亚硝酸盐。许多非食用细菌中NiR的分离纯化已被报道：Vigara从1944mgMonoraphidiumbraunii粗蛋白中纯化得到0.29mg铁氧还原蛋白–NiR[VigaraJ,García-SánchezMI,GarbayoI,etal.Purificationandcharacterizationofferredoxin–nitritereductasefromtheeukaryoticmicroalgaMonoraphidiumbraunii.PlantPhysiologyandBiochemistry,2002,40(5):401-405]；Ichiki从6170mg的Haloarculamarismortui粗蛋白中仅得到1.43mg的NiR[IchikiHandTanakaY.Purification,characterization,andgeneticanalysisofCu-containingdissimilatorynitritereductasefromadenitrifyingHalophilicArchaeon,Haloarculamarismortui.JournalofBacteriology,2001,183(14):4149–4156]；Inatomi对Haloferaxdenitrificans中的NiR进行纯化发现1060mg粗蛋白中只能得到0.08mg目的蛋白[InatomiKandHochsteinLI.ThepurificationandpropertiesofacoppernitritereductasefromHaloferaxdenitrificans.CurrentMicrobiology,1996,32:72-76]，国内外未见从蜡样芽孢杆菌中提纯NiR的研究。由于粗酶液中蛋白种类太多，而目的蛋白含量太低，导致纯化工作困难。为了提高NiR的含量，克隆表达技术得到了广泛的应用。通过克隆NiR基因然后在宿主细胞中大量表达，同时通过质粒使得重组蛋白带有特定标签从而简化纯化过程。

发明内容

为研究蜡样芽孢杆菌中NiR的性质，解决由于蜡样芽孢杆菌中NiR含量低而难于纯化的问题，本发明通过对其NiR编码基因的克隆表达来实现该蛋白在大肠杆菌中的大量表达，同时通过亲和层析法得到大量纯度较高的NiR，从而实现对LJ01中NiR的提纯。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶的基因，其核苷酸序列如NO.1所示。

一种蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶，由权利要求1所述基因编码的蛋白质。

含有上述蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶基因的重组质粒，该重组质粒中含组氨酸标签。

一种蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)以NCBI中蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶编码基因为模板，进行上下游引物设计，设计的酶切位点为NcoI、SalI；

(2)提取蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)LJ01的DNA，并以此为模板，通过PCR技术扩增蜡样芽孢杆菌LJ01亚硝酸盐还原酶的基因片段；所述蜡样芽孢杆菌LJ01的保藏编号为CGMCCNO.9360；