[发明专利]大黄鱼半乳糖凝集素LcGa重组蛋白的制备方法和应用

权利要求书

1.大黄鱼半乳糖凝集素LcGa重组蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)构建pGEX-6P1-LcGa重组表达载体；

(2)获得转化子高拷贝的大肠杆菌表达菌株pGEX-6P1-LcGa-BL21；

(3)转化子的发酵培养与诱导表达；

(4)重组蛋白LcGa的纯化。

2.如权利要求1所述大黄鱼半乳糖凝集素LcGa重组蛋白的制备方法，其特征在于在步骤(1)中，所述构建pGEX-6P1-LcGa重组表达载体的具体方法为：

提取大黄鱼脾脏的总RNA，进行cDNA的合成，合成包含BamHⅠ(GAATTC)和EcoRI(CTCGAG)内切酶位点的正反向引物，然后用特异性PCR扩增获得LcGa基因；

将得到的LcGaPCR产物与原核表达载体pGEX-6P1分别进行BamHⅠ和EcoRI双酶切，酶切产物回收后于16℃过夜连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α后重提质粒并用BamHⅠ和EcoRI双酶切鉴定，然后用特异性PCR扩增获得约1000bp的LcGa基因，证明pGEX-6P1-LcGa重组质粒构建成功；

所述正反向引物的序列为：

正向引物GF:CCGGAATTCATGGCTTTCCATCAGCAGTCAC，划线部分为BamHⅠ酶切位点；

反向引物GR:CCGCTCGAGCACAATCACAGATGTCAGACTG，划线部分为EcoRI酶切位点；

所用载体为pGEX-6P1。

3.如权利要求1所述大黄鱼半乳糖凝集素LcGa重组蛋白的制备方法，其特征在于在步骤(2)中，所述获得转化子高拷贝的大肠杆菌表达菌株pGEX-6P1-LcGa-BL21的具体方法为：

将构建好的载体冰上冷却后，热应激转化至大肠杆菌BL21(DE3)，加入无抗生素培养基复活培养，然后涂布于氨苄平板，经37℃培养12～16h，得到LcGa阳性转化克隆菌株。

4.如权利要求3所述大黄鱼半乳糖凝集素LcGa重组蛋白的制备方法，其特征在于所述载体冰上冷却的时间为30min,42℃热应激2min，无抗生素培养基加入比例为1∶4，复活培养的时间为80min。

5.如权利要求1所述大黄鱼半乳糖凝集素LcGa重组蛋白的制备方法，其特征在于在步骤(3)中，所述转化子的发酵培养与诱导表达的具体方法为：

将阳性转化子细菌pGEX-6P1-LcGa-BL21接种于LB培养基中，37℃，200rpm，过夜振荡培养；再转接到新的含氨苄的LB液体培养基中诱导表达。

6.如权利要求5所述大黄鱼半乳糖凝集素LcGa重组蛋白的制备方法，其特征在于所述过夜振荡培养的细菌按照1∶100比例转接到新的含氨苄的LB液体培养基；

所述诱导表达的条件为：菌液OD600值0.6～0.8，0.1mM的IPTG，18℃，90rpm过夜诱导12h。

7.如权利要求1所述大黄鱼半乳糖凝集素LcGa重组蛋白的制备方法，其特征在于在步骤(4)中，所述重组蛋白LcGa的纯化的具体方法为：

将诱导的菌液离心收集，用PBS洗涤并重悬，超声波破碎，4℃，12000g，离心20min，分离出蛋白上清和沉淀，检测到LcGa以可溶性蛋白纯在，弃去沉淀，经洗脱液通过谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱纯化，最终获得高纯度的LcGa重组蛋白；

所述洗脱液的配方可为：50mMTris-clpH8.0,20mMGlutathione。

8.如权利要求1～7中任一所述制备方法所制备的大黄鱼半乳糖凝集素LcGa重组蛋白在介导细菌凝集中应用，并且不依赖钙离子的存在。

9.如权利要求1～7中任一所述制备方法所制备的大黄鱼半乳糖凝集素LcGa重组蛋白在介导红细胞凝集中应用。

10.如权利要求1～7中任一所述制备方法所制备的大黄鱼半乳糖凝集素LcGa重组蛋白在制备鱼类免疫添加剂和细菌防治药物中应用。