[发明专利]大黄鱼半乳糖凝集素LcGa重组蛋白的制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种大黄鱼半乳糖凝集素LcGa重组蛋白的制备方法和应用。

背景技术

大黄鱼是我国养殖量最大的海水经济鱼类之一，也是福建省最具特色的海水养殖鱼类，每年直接产值达数十亿元。但随着大黄鱼养殖的规模化发展，病害问题日趋严重，每年造成数亿元的经济损失，严重影响了大黄鱼养殖业的经济与生态效益。大黄鱼的致病病原复杂多变，有病毒、细菌、寄生虫和其它未诊断的新生病原，其中以弧菌和刺激隐核虫感染最为严重。因此，深入了解其天然免疫系统，通过多途径联合运用最大限度地提高鱼类免疫力，进而提高大黄鱼产量已成为一个迫在眉睫的问题。

半乳糖凝集素是一类含有一个保守的糖识别域的β-半乳糖苷结合凝集素，广泛分布于各种动植物体内。目前在哺乳动物共发现15种半乳糖凝集素，广泛参与许多生理和病理过程，包括细胞间粘附、细胞生长调节、RNA转录后加工、炎症反应、免疫调节、肿瘤转化以及细胞凋亡等(VastaGR,FengC,BianchetMA,BachvaroffTR,TasumiS.Structural,functional,andevolutionaryaspectsofgalectinsinaquatic.mollusks:FromasweettoothtotheTrojanhorse[J].FishShellfishImmunol.2015,46:94-106.)。近年，发现半乳糖凝集素能够识别细菌、病毒、寄生虫和真菌表面的糖苷，因此，半乳糖凝集素作为模式识别受体日益受到广泛的关注(delaFuenteH,CibriánD,Sánchez-Madrid.FImmunoregulatorymoleculesaremasterregulatorsofinflammationduringtheimmuneresponse[J].FEBSLett.2012,586:2897-2905.)。半乳糖凝集素在免疫防御过程中可以起到识别和凝集外源性异物颗粒，将病原局限在一定范围内，防止病原蔓延扩散(ChenHY,WengIC,HongMH,LiuFT.Galectinsasbacterialsensorsinthehostinnateresponse[J].CurrOpinMicrobiol.2014,17:75-81.)。目前在鱼类分离到的半乳糖凝集素非常有限，本发明所述半乳糖凝集素为大黄鱼首例报道的半乳糖凝集素。

目前报道的鱼类各类凝集素大多是C型凝集素，并以包涵体形式存在，包涵体存在复性困难且很难保持生物学活性等问题，因此，在实际应用中受到很大程度的限制。

发明内容

本发明的第一个目的在于针对现有技术中存在的上述不足，提供一种大黄鱼半乳糖凝集素LcGa重组蛋白的制备方法。

本发明的第二个目的在于提供大黄鱼半乳糖凝集素LcGa重组蛋白在介导细菌的凝集中的应用。

本发明的第三个目的在于提供大黄鱼半乳糖凝集素LcGa重组蛋白在介导红细胞凝集中的应用。

本发明的第四个目的在于提供大黄鱼半乳糖凝集素LcGa重组蛋白在制备鱼类免疫添加剂和细菌防治药物中的应用。

所述大黄鱼半乳糖凝集素LcGa重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)构建pGEX-6P1-LcGa重组表达载体；

(2)获得转化子高拷贝的大肠杆菌表达菌株pGEX-6P1-LcGa-BL21；

(3)转化子的发酵培养与诱导表达；

(4)重组蛋白LcGa的纯化。

在步骤(1)中，所述构建pGEX-6P1-LcGa重组表达载体的具体方法可为：

提取大黄鱼脾脏的总RNA，进行cDNA的合成，合成包含BamHⅠ(GAATTC)和EcoRI(CTCGAG)内切酶位点的正反向引物，然后用特异性PCR扩增获得LcGa基因；

将得到的LcGaPCR产物与原核表达载体pGEX-6P1分别进行BamHⅠ和EcoRI双酶切，酶切产物回收后于16℃过夜连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α后重提质粒并用BamHⅠ和EcoRI双酶切鉴定，然后用特异性PCR扩增获得约1000bp的LcGa基因，证明pGEX-6P1-LcGa重组质粒构建成功；

所述正反向引物的序列为：

正向引物GF:CCGGAATTCATGGCTTTCCATCAGCAGTCAC(划线部分为BamHⅠ酶切位点)；