[发明专利]一种溶藻弧菌、副溶血性弧菌及创伤弧菌多重降落PCR检测方法

权利要求书

1.一种检测溶藻弧菌、副溶血性弧菌及创伤弧菌多重降落PCR检测方法，其特征在于，由以下步骤制备而成：

取待检样本于0.5ml碱性蛋白胨水中37℃培养6h，取液体300μl，4000rmp离心，留取沉淀加入50μl无菌水，震荡15秒钟，置100℃沸水中煮沸10min，冰上放置3～5分钟，1,3000转离心5分钟，取上清液约30μl即为DNA提取液；

取下列浓度及体积的组分混合成25μl的反应体系：

缓冲液10×PCR2.5μl；

VAtoxR-F10μmol/L0.2μl；

VAtoxR-R10μmol/L0.2μl；

VPcol–F10μmol/L0.4μl；

VPcol–R10μmol/L0.4μl；

VVvvhA-F10μmol/L0.4μl；

VVvvhA-R10μmol/L0.4μl；

16S–F10μmol/L0.4μl；

16S–R10μmol/L0.4μl；

MgCl₂25mM1.5μl；

dNTP10mM2μl；

TaqDNA聚合酶5U/μl0.2μl；

DNA模板1μl；

ddH2O15μl；

进行PCR循环反应，循环参数如下：

94℃8min；94℃40s,65℃：每循环降低0.5℃，25s,72℃1min，20个循环；94℃40s,55℃25s,72℃1min,20个循环；72℃8min；

电泳检测鉴定：

对PCR反应产物进行琼脂糖电泳检测，如电泳图中含有740bp、598bp、349bp和246bp条带，其中740bp、349bp和246bp分别代表检出创伤弧菌、副溶血性弧菌和溶藻弧菌，598bp则代表提取出有效的模板；

所述VAtoxR-F的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；

所述VAtoxR-R的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；

所述VPcol-F的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；

所述VPcol-R的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；

所述VVvvhA-F的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；

所述VVvvhA-R的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；

所述16S内参-F的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；

所述16S内参-R的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。