[发明专利]一种溶藻弧菌、副溶血性弧菌及创伤弧菌多重降落PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种可快速特异检测溶藻弧菌(VA)、副溶血性弧菌(VP)及创伤弧菌(VV)的多重降落PCR试剂盒及方法，具体是一种可快速特异检测溶藻弧菌(VA)、副溶血性弧菌(VP)及创伤弧菌(VV)的多重降落PCR试剂盒和使用方法。

背景技术

弧菌是一类可引起肠道感染的细菌，它会引发肠胃炎和霍乱等疾病。弧菌属广泛分布河口、海湾、近岸海域的海水和海洋动物体内。同时也是引起海水养殖动物细菌性疾病的最重要的病原菌之一，大量的研究和生产实践表明，弧菌病就是由弧菌属细菌引起的一类细菌性疾病，流行广，发病率高。主要的病原弧菌有溶藻弧菌(VA)、副溶血性弧菌(VP)及创伤弧菌(VV)等十多种弧菌。

溶藻弧菌海水中常见嗜盐性弧菌，1973年开始明确对人类致病，易污染食物，引起腹泻及创伤部位感染。

副溶血性弧菌是一种海洋细菌，主要来源于鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品。进食被副溶血性弧菌污染的食物后10小时左右出现上腹部阵发性绞痛、腹泻，多数患者在腹泻后出现恶心、呕吐，腹泻多为水样便，重者为黏液便和黏血便。呕吐、腹泻严重，失水过多者可引起虚脱并伴有血压下降。大部分病人发病后2~3天恢复正常，少数严重病人由于休克、昏迷而死亡。

创伤弧菌（Vibriovulnificus）的感染造成临床上的病症有两种，即原发性败血症和严重的窗口感染，也可导致坏死性胃肠炎、脑膜炎、肺炎、眼角膜炎等疾病。败血症多与生食含菌的牡蛎等贝类海产品有关，尤其好发于肝硬化、血色素沉着症、地中海贫血等体内荷铁量过多的人群中，病死率超过50%。皮肤创口受海水中的创伤弧菌感染，常导致严重的组织坏死。

目前，多重PCR主要应用于可引起人类疾病的弧菌检测，如食品检测等，而在水产动物弧菌基本上都是沿用普通PCR方法，一次只能检测一种弧菌，检测所需时间长且常常造成漏检或误检。

发明内容

本发明是为了解决现有的技术所存在的PCR方法检测水产动物弧菌病致病菌，一次性只能检测一种弧菌，检测所需时间长，且造成漏检或误检现象的问题。提供一种可以同时检测多种弧菌致病菌检测的多重PCR方法。

本发明的技术方案是：

一种可同时检测溶藻弧菌(VA)、副溶血性弧菌(VP)及创伤弧菌(VV)的多重PCR检测方法，其特征在于依次按如下步骤进行：

（一）适量待检样本(粪便、培养物或环境样品)于0.5ml碱性蛋白胨水中37℃培养6h，取液体300μl，4000rmp离心，留取沉淀加入50μl无菌水，震荡15秒钟，置100℃沸水中煮沸10min，冰上放置3～5分钟，1,3000转离心5分钟，取上清液约30μl即为DNA提取液。

（二）多重降落PCR所需的引物：

VAtoxR-F：5’-CAACTCATTTGTTCAGTGGAACGC-3’（SEQIDNO.1）

VAtoxR-R：5’-TACRCAAAYAGGAAGCAGYAGAG-3’（SEQIDNO.2）

VPcol-F：5’-GTAGTACGCTTCCGCAAGATTG-3’（SEQIDNO.3）

VPcol-R：5’-CAAGCTTCCGCGTCAAAATCTAC-3’（SEQIDNO.4）

VVvvhA-F：5’-GTTTTACTCCTGACGCCAAAATTGTC-3’（SEQIDNO.5）

VVvvhA-R：5’-GCGAATACGTTGTTTCACAGTACTG-3’（SEQIDNO.6）

16S内参-F:5’-CAGCAGCCGCGGTAATACG-3’（SEQIDNO.7）

16S内参-R:5’-GCTCGTTGCGGGACTTAACC-3’（SEQIDNO.8）

（三）多重降落PCR法扩增检测待检样本DNA中的VAtoxR、VPcol、VVvvhA和16S内参基因，具体步骤如下：

反应体系：25μl

缓冲液（10×PCR）2.5μl

VAtoxR-F（10μmol/L）0.2μl

VAtoxR-R（10μmol/L）0.2μl