[发明专利]基于环介导等温扩增技术检测胡萝卜软腐果胶杆菌的方法、其引物组合物及检测试剂盒

说明书

本发明涉及基于环介导等温扩增技术检测胡萝卜软腐果胶杆菌的方法、其引物组合物及检测试剂盒，其中，用于检测胡萝卜软腐果胶菌的LAMP引物组由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、环引物LOOP组成。本发明的引物组合物及检测试剂盒特异性高、灵敏度好，明显优于现有技术的其他检测手段；与传统PCR相比，本发明的检测方法及试剂盒结果可视，操作简单，成本低廉；能有效实现多种植物发病组织总DNA中的胡萝卜软腐果胶杆菌检测，且可对胡萝卜软腐果胶杆菌菌悬液进行直接检测，为病害的田间直接诊断奠定基础。

【技术领域】

本发明基因检测诊断领域，具体涉及一种基于环介导等温扩增技术检测胡萝卜软腐果胶杆菌的方法，其涉及的引物组合物、所述引物组合物的应用及胡萝卜软腐果胶杆菌的检测试剂盒。

【背景技术】

胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)是引起蔬菜细菌性软腐病的一种世界性流行病害，其宿主范围十分广泛，可以引起多种园艺作物例如芹菜、胡萝卜、番茄、黄瓜、马铃薯、甜瓜等发生软腐病并带来巨大的经济损失。由于胡萝卜软腐果胶杆菌的致病性较强，病害一但发生很难防治，且市场上缺乏针对细菌性软腐病的专一性杀菌剂，因此目前该病害的防治以预防为主。对于预防病害的发生，早期的病原菌检测技术显得尤为重要。

植物病原微生物检测通常采用形态学、生理生化及分子技术手段。随着生物信息及DNA测序技术的发展，分子检测技术的应用正在向检测广度及深度多层次进行深入。目前常用的病原菌分子检测技术包括：普通PCR、荧光定量PCR、免疫测定法等。这些检测技术的应用通常因昂贵的实验仪器及苛刻的实验条件而受到一定的限制，很难实现病害病原微生物的田间现场检测。

目前用于检测软腐果胶杆菌的方法包括普通PCR、巢式PCR及荧光定量PCR等，该类检测方法需要依赖精密的温度循环装置，检测过程复杂，检测时间较长，不能满足病原菌快速检测的需要。

例如中国发明专利申请CN 102559901A公开了一种特异性检测胡萝卜软腐果胶杆菌的PCR方法，以致病菌果胶裂解酶基因特异的引物对待测样品进行PCR扩增，最后电泳鉴定。并公开其特异性引物包括正向引物：5’-CTATAGCGGTAATGAAG-3’，反向引物：5’-TTACCGACGCCAGCATAG-3’。

然而，该技术中所用引物未进行实验验证，也没有对引物进行灵敏性检测，且特异性检测中仅涉及了3种其它对照菌株，其灵敏性及特异性存在争议。而且，其PCR扩增方法只能对菌株提取后的DNA进行检测，不能实现菌悬液的直接检测。更重要的是该方法检测所需要的时间在2小时以上，扩增产物不能直接目视检测，必须通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，操作繁复。

2000年，日本荣研化学株式会社开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法即环介导等温扩增技术(Loop-Mediated IsothermalAmplification，LAMP)，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63℃左右)保温60分钟左右，即可完成核酸扩增反应。LAMP反应的结果可以通过电泳检测形成梯形条带，也可以通过加入不同种类的核酸染料进行目视观察。然而，目前尚缺乏将LAMP技术应用于胡萝卜软腐果胶杆菌检测的技术的设想及验证。

【发明内容】

本发明的目的是克服现有技术缺陷，针对现有的胡萝卜软腐果胶杆菌的生物学检测方法耗时长、操作复杂、准确性差等缺陷，并针对PCR检测技术必须依赖热循环仪器、因此无法快速检测胡萝卜软腐果胶杆菌从而存在推广困难的问题，提供了一种胡萝卜软腐果胶杆菌的新型检测方法及实现该方法的特异性引物及检测试剂盒。

本发明基于将环介导等温扩增技术应用至胡萝卜软腐果胶杆菌检测的思路，提供了用于检测胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovor um)的引物组合物，所述引物组合物由以下组成：