[发明专利]兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用在审

专利信息
申请号: 201510496627.5 申请日: 2015-08-13
公开(公告)号: CN105085676A 公开(公告)日: 2015-11-25
发明(设计)人: 卜登攀;孙鹏;王加启;王建;南雪梅;杜洪 申请(专利权)人: 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
主分类号: C07K16/18 分类号: C07K16/18;C07K1/34;C07K1/22;G01N33/68
代理公司: 北京康思博达知识产权代理事务所(普通合伙) 11426 代理人: 余光军;李霞
地址: 100193 *** 国省代码: 北京;11
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摘要:
搜索关键词: 牛乳 铁蛋白 克隆 抗体 及其 制备 方法 应用
【权利要求书】:

1.一种兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:

(1)将乳铁蛋白与免疫佐剂混合,得到含有复合佐剂的乳铁蛋白溶液;

(2)用含有复合佐剂的乳铁蛋白溶液免疫新西兰白兔,获取抗血清;离心,取上清,得到抗血清;

(3)将抗血清依次用免疫磁珠法和蛋白A亲和层析法进行纯化,得到纯化的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体。

2.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于:将乳铁蛋白与CpG佐剂溶于PBS中得到混合溶液,再与Al(OH)3混合,得到含有复合佐剂的乳铁蛋白溶液;优选的,将0.5mg乳铁蛋白与50μgCpG佐剂溶于1mLPBS中得到混合溶液;将混合溶液与Al(OH)3按照1:5的体积比混合,得到含有复合佐剂的乳铁蛋白溶液。

3.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的免疫方式包括:采用皮下多点注射法的方式将含有复合佐剂的乳铁蛋白溶液免疫新西兰白兔,免疫的次数为4次。

4.按照权利要求3所述的制备方法,其特征在于:其中,第1次免疫的4周后,进行第2次免疫;以后每2周重复免疫1次,进行第3次和第4次免疫;第4次免疫后的第7天收集抗血清;优选的,第1次免疫时,每只兔免疫500μg乳铁蛋白;第2次、第3次和第4次免疫时,每只兔每次免疫250μg乳铁蛋白。

5.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述免疫磁珠法纯化抗血清包括:将磁珠加入到离心管中,在磁力分离器上放置,吸去上清液,加入稀释的抗血清,静置,吸去上清液;重悬磁珠,重复清洗,吸去上清液;加入枸橼酸钠缓冲液,涡旋震荡,静置,吸取上清液,重复清洗,将所得上清液混合,得到纯化后抗体;

优选的,取100μL磁珠加入2mL离心管中,在磁力分离器上放置3min后吸去上清液,加入300μL按照1:100的比例稀释的抗血清,4℃条件下保持倾斜缓慢旋转10min,而后静置3min后吸去上清液,用pH=7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬磁珠,重复清洗3遍后,离心管再次在磁力分离器上放置3min吸去上清液,加入pH3.0的0.1mol/L枸橼酸钠缓冲液,涡旋震荡3min,然后再在磁力分离器上放置2min后吸取上清液,重复清洗3遍,将所得上清液混合,得到纯化后抗体。

6.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述将抗血清用蛋白A亲和层析法进行纯化的方式包括:

上样前首先用结合/洗涤缓冲液平衡蛋白A-琼脂糖-4B并装柱,洗去所含蛋白质等杂质,待流出洗脱液OD280<0.02时;将结合/洗涤缓冲液稀释后的抗血清加入柱中,待全部血清样品进入柱床后,用结合/洗涤缓冲液冲洗柱子,待洗脱液OD280<0.02时,用pH=2.8的3.5%冰乙酸洗脱,将含有抗体的洗脱液收集到含平衡缓冲液的容器中,浓缩,即得;

优选的,所述的结合/洗涤缓冲液为含有1MNaCl的0.1mol/LTris-HCl缓冲液,其pH=8.6;

上样前首先用结合/洗涤缓冲液平衡蛋白A-琼脂糖-4B并装柱,以1mL/min流速洗去杂质;待流出洗脱液OD280<0.02时,将结合/洗涤缓冲液稀释后的血清样本(1:4,v/v)加入柱中,待全部血清样品进入柱床后,用结合/洗涤缓冲液冲洗柱子并使缓冲液流出速度约1mL/min,待洗脱液OD280<0.02时,用pH=2.8的3.5%冰乙酸洗脱,将含有抗体的洗脱液收集到含平衡缓冲液的容器中以中和洗脱液pH至7.3;

所述的浓缩是用10kDa超滤管进行浓缩。

7.由权利要求1-6任何一项制备方法得到的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体。

8.权利要求7所述的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体在定性或定量检测乳、乳制品或乳腺中乳铁蛋白中的应用。

9.一种定性或定量检测乳铁蛋白的ELISA试剂盒,包括:检测抗体、抗体稀释液、包被缓冲液、封闭液、PBS缓冲液、洗涤缓冲液、终止液;其特征在于:所述的检测抗体是权利要求7所述的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体。

10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于:

所述包被缓冲液是:溶剂为超纯水,溶质为Na2CO3和NaHCO3,所述溶质Na2CO3和NaHCO3在包被缓冲液中的浓度为0.05M,pH为9.6;

所述封闭液是:溶剂为超纯水,溶质为卵清白蛋白,所述溶质卵清白蛋白在封闭缓冲液中的浓度为1%;

所述PBS缓冲液是:溶剂为超纯水,溶质为NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4,所述溶质NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4在所述PBS缓冲液中的浓度分别为8g/L、0.2g/L、0.2g/L和0.46g/L,pH值为7.4;

所述洗涤缓冲液是:溶剂为所述PBS缓冲液,溶质为吐温-20,所述溶质吐温-20在所述洗涤缓冲液中的浓度为50mL/L;

所述抗体稀释液是:溶剂为所述PBS缓冲液,溶质为吐温-20和明胶,所述溶质吐温-20和明胶在所述抗体稀释液中的浓度分别为10mL/L和0.01M;

所述终止液是:2M的硫酸水溶液;

所述底物溶液A:溶剂为超纯水,溶质为过氧化氢脲、Na2HPO4、柠檬酸和吐温-20,所述过氧化氢脲、Na2HPO4、柠檬酸和吐温-20在所述底物溶液A中浓度分别为1g/L、14.2g/L、9.42g/L和0.1mL/L;

所述底物溶液B:溶剂为超纯水,溶质为四甲基联苯胺、柠檬酸和硫代硫酸钠,四甲基联苯胺、柠檬酸和硫代硫酸钠在所述底物溶液B中的浓度分别为0.4g/L、1.83g/L和0.1g/L。

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