[发明专利]兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域。本发明涉及一种多克隆抗体，尤其涉及兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体，本发明进一步涉及该兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体在定性和定量检测乳、乳制品或乳腺中乳铁蛋白中的应用。

背景技术

近年来，人们对乳品质的要求越来越高，乳蛋白作为衡量乳品质的重要指标，其合成的营养调控已经成为奶牛营养学研究的热点。乳铁蛋白也称为乳运铁蛋白(lactoferrin，Lf)，是牛奶中重要生物活性物质之一，具有调节铁吸收，广谱抗细菌感染，调节机体免疫反应，抗氧化、抗癌、抗病毒等多种功效。乳铁蛋白在人初乳中含量较高，浓度为6-8mg/mL；奶牛初乳中浓度为1-2mg/mL，而在常乳中的含量较低，人常乳中浓度仅为1-2mg/mL，奶牛常乳中浓度仅为0.02-0.35mg/mL。由于人乳来源有限，因此牛乳即成为人们获取乳铁蛋白的最直接途径。为检测乳与乳制品中乳铁蛋白的含量，有效降低牛奶加工过程中造成的损失，需要建立一种快速、准确的测定生鲜乳及乳制品中乳铁蛋白含量的方法。

截至目前，乳铁蛋白的定性和定量检测方法主要包括随机免疫扩散法(RID)、放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)方法、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)以及高效液相色谱法(HPLC)等。其中，RID和RIA方法检测范围有限，准确性差，且存在一定放射危害。SDS-PAGE法相对耗时较长，且不易于准确定量，不宜检测大批量样品。HPLC法虽可准确定量，但其检测对象有限，仅适合检测液态奶和奶粉样品，且对样品纯度有一定要求，仅适用于高纯度样品测定，样品前处理过程相对复杂，同时仪器设备昂贵，且对于仪器的操作技能要求较高。

相比之下，酶联免疫吸附测定(ELISA)方法是检测特定蛋白的有效方法，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。结合SDS-PAGE及Western-blot，可用于针对特定抗原的定性和定量检测。但是，利用酶联免疫吸附测定方法检测生鲜乳及乳制品中的乳铁蛋白含量，需要用到相应的乳铁蛋白抗体。

现有的乳铁蛋白多克隆抗体多不同程度的存在效价较低、纯度不高、特异性不强等缺陷，限制了其在检测生鲜乳及乳制品中的乳铁蛋白含量中的应用，有待改进。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种效价高、纯度高、特异性强的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体，为定量检测乳及乳制品中以及奶牛乳腺中合成的乳铁蛋白提供有效研究材料。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体，其通过以下方法制备得到：

(1)将乳铁蛋白与免疫佐剂混合，得到含有复合佐剂的乳铁蛋白溶液；

(2)用含有复合佐剂的乳铁蛋白溶液免疫兔，获取抗血清；离心，取上清，得到抗血清，备用；

(3)将抗血清依次用免疫磁珠法和蛋白A亲和层析法进行纯化，得到纯化的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体。

其中，步骤(1)中将乳铁蛋白与CpG佐剂溶于PBS中得到混合溶液，再与Al(OH)₃混合，得到含有复合佐剂的乳铁蛋白溶液；优选的，将0.5mg乳铁蛋白与50μgCpG佐剂溶于1mLPBS中得到混合溶液；将混合溶液与Al(OH)₃按照1:5的体积比混合，得到含有复合佐剂的乳铁蛋白溶液。

所述的免疫方式包括：采用皮下多点注射法的方式将含有复合佐剂的乳铁蛋白溶液免疫新西兰白兔，免疫的次数为4次；其中，第1次免疫4周后，进行第2次免疫；以后每2周重复免疫1次，进行第3次和第4次免疫；第4次免疫后的第7天收集抗血清。为了达到更好的技术效果，在第1次免疫时，每只兔免疫500μg乳铁蛋白；第2次、第3次和第4次免疫时，每只兔每次免疫250μg乳铁蛋白。

将抗血清通过不同的方式进行纯化，所获得的乳铁蛋白多克隆抗体的纯度存在较大的差异；本发明通过筛选试验发现，采用饱和硫酸铵法纯化抗血清所获得的乳铁蛋白多克隆抗体的纯度仅为62％，采用免疫磁珠法联合蛋白A亲和层析法纯化抗血清所获得的乳铁蛋白多克隆抗体的纯度达到87％以上，远远高于了饱和硫酸铵法这种纯化方式；因此，本发明优选采用免疫磁珠法联合蛋白A亲和层析法纯化抗血清。

所述免疫磁珠法纯化抗血清包括：将磁珠加入到离心管中，在磁力分离器上放置吸去上清液，加入稀释的抗血清，静置，吸去上清液；重悬磁珠，重复清洗，吸去上清液；加入枸橼酸钠缓冲液，涡旋震荡，静置，吸取上清液，重复清洗，将所得上清液混合，得到纯化后抗体；