[发明专利]一种区域选择性专一的转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的应用

权利要求书

1.一种区域选择性专一的转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的应用，所述转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，步骤如下：

将转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶与对硝基苯-N-乙酰-β-D-已糖胺和乳糖溶液混合，配制成反应体系，在45～55℃条件下，反应1.5～4h，终止反应，纯化，制得N-乙酰已糖胺寡糖。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的制备方法如下：

（1）将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因序列插入质粒pET-21b中，转化大肠杆菌大肠杆菌BL21（DE3），制得重组大肠杆菌；

（2）将步骤（1）制得的重组大肠杆菌经扩大培养，再经过诱导培养后，收集细胞，细胞破碎、纯化，制得转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因序列以两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）JCM1254的基因组DNA为模板，经PCR扩增获得，PCR引物核苷酸序列如下所示：

引物F：5’-agtcaagcttagcgatgacaatcttgcact-3’

Hind III

引物R：5’-atatctcgagggcgacctcgtcaggcgtgt-3’

XhoI

PCR体系如下，总体积100µL：

10×PCR buffer 10μL，2.5mmol/L dNTP 8μL、20µmol/L引物各2μL、100ng/μL模板1μL、5U/μL TaKaRa LA Taq酶1μL，超纯水76μL；

PCR扩增程序如下：

95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸5分钟，反应30个循环；72℃延伸10分钟。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，扩大培养条件为：37℃、150～180r/min培养至OD₆₀₀为0.4～0.6。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，扩大培养基为LB培养液，配制方法如下：

蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 7g/L、pH 7.0，121℃灭菌20分钟。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述扩大培养基还包括浓度为40～60µg/mL的氨苄霉素。

7.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，诱导培养为在扩大培养后，向培养液中加入IPTG，使培养液中IPTG的浓度为0.5mM～1mM，在25～28℃、100r/min继续过夜培养。

8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述反应体系中，对硝基苯-N-乙酰-β-D-已糖胺的反应浓度为10～20mM，乳糖反应浓度为300～400mM，pH为5.0～6.0。

9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述反应体系由浓度为50mM的磷酸钠缓冲液配制，pH为5.8。

10.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纯化采用柱层析进行纯化。