[发明专利]一种区域选择性专一的转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的应用

说明书

本发明涉及一种区域选择性专一的转糖基β‑N‑乙酰氨基已糖苷酶的应用，步骤如下：将转糖基β‑N‑乙酰氨基已糖苷酶与对硝基苯‑N‑乙酰‑β‑已糖胺和乳糖溶液混合，配制成反应体系，反应后，终止，纯化，制得N‑乙酰已糖胺寡糖。该方法所需要的底物价格便宜，易于获得，且反应条件温和，操作简便，大大降低了N‑乙酰已糖胺寡糖的生产成本，适合于GlcNAcβ1‑3Galβ1‑4Glc和GalNAcβ1‑3Galβ1‑4Glc的规模化合成，具有潜在的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种区域选择性专一的转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的应用，特别涉及一种β-N-乙酰氨基已糖苷酶专一性合成N-乙酰已糖胺寡糖的应用，属于糖苷酶应用技术领域。

技术背景

β-N-乙酰氨基已糖苷酶(β-N-acetylhexosaminidases，EC.3.2.1.52)是一类重要的糖苷水解酶，催化β-N-乙酰氨基已糖苷键的水解，广泛分布于细菌、真菌，植物和动物中，根据氨基酸序列同源性归属于糖苷酶家族GH3、GH20和GH84(http://www.cazy.org/)。其中，细菌来源的β-N-乙酰氨基已糖苷酶在三个家族中均有分布，真核生物来源的主要属于GH20。该类酶既可以水解简单的β-N-乙酰氨基已糖苷，也可以作用于含β-N-乙酰氨基已糖苷键的大分子，如多糖、糖蛋白和糖脂。此外，某些β-N-乙酰氨基已糖苷酶不仅具有水解功能，在体外合适的反应条件下还具有转β-N-乙酰氨基已糖苷的活性，合成重要N-乙酰氨基已糖苷化合物，应用于基础研究、农业和医药等领域，但目前报道的酶转糖基区域选择性不严格，合成产物存在同分异构体，不利于产物纯化，并且产物产量很低。

N-乙酰已糖胺寡糖的合成具有重要意义，如寡糖GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(即lacto-N-trioseII)是存在于母乳低聚糖和很多血型抗原中的糖链结构，但目前糖苷酶法合成产率很低，不超过10％；寡糖GalNAcβ1-3Galβ1-4Glc是血型P抗原的类似物，但目前糖苷酶法合成还是空白。由于现有的合成方法均存在局限性，使得N-乙酰已糖胺寡糖的商品价格一直非常昂贵，需要寻找新的酶源和经济有效的合成方法。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种β-1,3区域选择性专一的高效转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的应用。

发明概述

本发明的技术要点是利用区域选择性专一的β-N-乙酰氨基已糖苷酶以对硝基苯-N-乙酰-β-D-已糖胺为糖基供体，以乳糖为受体，一步转糖基反应高效合成单一的N-乙酰已糖胺寡糖产物。

发明详述

一种区域选择性专一的转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的应用，所述转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述应用，步骤如下：

将转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶与对硝基苯-N-乙酰-β-D-已糖胺和乳糖溶液混合，配制成反应体系，在45～55℃条件下，反应1.5～4h，终止反应，纯化，制得N-乙酰已糖胺寡糖。

根据本发明优选的，所述转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的制备方法如下：

(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因序列插入质粒pET-21b中，转化大肠杆菌BL21(DE3)，制得重组大肠杆菌；

(2)将步骤(1)制得的重组大肠杆菌经扩大培养，再经过诱导培养后，收集细胞，细胞破碎、纯化，制得转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶。