[发明专利]一种通过纳米金颗粒介导基因转染诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属细胞生物学和发育生物学领域，具体涉及一种通过纳米金颗粒介导基因转染诱导人脐带间充质干细胞分化睾丸间质细胞的方法。

背景技术

男性更年期综合征，是由于睾丸的萎缩，睾丸酮的分泌减少，萎缩的睾丸对促性腺激素的反应降低，使体内性激素的调节功能失衡而引起的一系列症状。主要表现为精神心理症状：精力不集中，记忆力减退，抑郁，焦虑，易怒，多疑，神经质，工作能力下降。血管舒缩症状有心悸，潮热，出汗。性方面的症状有性兴趣降低，性欲降低，阳痿。生理体能症状有睡眠减少，容易疲劳，食欲不振，骨骼与关节疼痛。

目前临床主要应用化学合成的雄性激素进行替代治疗。然而人体长期应用化学合成雄激素易引起肝功能损害、高血脂症及前列腺癌等并发症，短期过量补充还可引起人情绪不稳等多种副反应。近年来国内外专家尝试开展了近亲供体移植术或干细胞移植术治疗睾丸损失或男性性腺低下症，取得较好效果。但这种移植术存在供体来源有限、手术复杂、经费高等缺点，受者需长期服用免疫抑制剂等。

近来，调节睾丸间质细胞合成分泌雄激素的因素也越来越受到人们的重视。经调研，尚未见经纳米金颗粒介导基因转染诱导人脐带间充质干细胞分化睾丸间质细胞的方法相关报道。

发明内容

本发明的一个目的是构建一种通过纳米金颗粒介导基因转染诱导人脐带间充质干细胞分化睾丸间质细胞的方法，主要是通过10-30nm直径的纳米胶体金颗粒将类固醇生成因子1(SteroidogenicFactor1，SF-1)和促黄体生成激素受体(luteotropichormonereceptor，LHR)质粒共转染入人脐带间充质干细胞，然后用化合物或生长因子诱导人脐带间充质干细胞定向分化为睾丸间质细胞，进而分泌生成睾酮。

一种通过纳米金颗粒介导基因转染诱导人脐带间充质干细胞分化睾丸间质细胞的方法，包含以下步骤：

1)纳米金颗粒的合成，纳米金颗粒对基因载体的包被，纳米金颗粒介导的基因转染；

2)采用化合物或生长因子诱导人脐带间充质干细胞定向分化为睾丸间质细胞

所述纳米金颗料为直径10-30nm的纳米胶体金颗粒，优选20nm。

所述纳米金颗料的合成过程如下：

　(1)将氯金酸(HAuC1₄)配制成0.01％水溶液，取100mL加热至沸。

(2)搅动下准确加入1.5mL的1%柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O）水溶液。

(3)继续加热煮沸15min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。全过程约2－3min。

(4)冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积备用。

所述纳米金颗粒介导的基因包被及基因转染，其步骤如下：

将人脐带间充质干细胞进行常规贴壁培养，按6孔培养板中每孔4×10⁵个细胞，并按以下试剂量操作：取两种待转质粒(分别含类固醇生成因子1基因和促黄体生成激素受体基因)各2μg溶于100μlPBS缓冲液，再加入16μl纳米金颗粒溶液，涡旋1s混匀，室温放置2-5min后加入细胞中；转染24小时更换培养液后换成诱导培养液；

采用化合物或生长因子诱导人脐带间充质干细胞定向分化为睾丸间质细胞，在转染24小时后加入以下配方的诱导培养基：5×10^-7mol/L维Ａ酸和1×10^-3mol/L8-溴-环磷腺苷，诱导分化7天后，检测睾丸间质细胞中类固醇合成相关蛋白。

有益效果：

本发明提供一种通过纳米金颗粒介导基因转染诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，所述方法高效、安全，分化后的睾丸间质细胞可作为研究替代模型；可用于以睾丸间质细胞在临床上细胞治疗的种子细胞，提高睾丸间质细胞再生替代治疗的应用前景。

所述方法开拓了一种新的干细胞基因转染途径，为干细胞分化为睾丸间质细胞提供一种高效、安全的方法；

所述方法分化后的睾丸间质细胞能作为研究睾丸间质细胞分泌调节功能影响因素研究的替代模型。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，但是本发明的范围不受这些实施例的限制。

一种通过纳米金颗粒介导基因转染诱导人脐带间充质干细胞分化睾丸间质细胞的方法，包含以下步骤：

3)纳米金颗粒的合成，纳米金颗粒对基因载体的包被，纳米金颗粒介导的基因转染；