[发明专利]一种高产普鲁兰酶的重组短小芽孢杆菌及其应用

说明书

本发明公开了一种高产普鲁兰酶的重组短小芽孢杆菌及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明通过构建重组质粒pulA/pSVEB，并转化至短小芽孢杆菌Brevibacillus brevis(CCTCC AB94025)中，得到重组菌pulA/pSVEB/Brevibacillus brevis。该菌株产普鲁兰酶的发酵培养基为：葡萄糖30g/L，牛肉浸膏30g/L，棉籽粉5g/L，MgCl₂·6H₂O 12g/L。培养条件为：发酵温度30℃，pH为7.0。本发明实现了普鲁兰酶在短小芽孢杆菌中的胞外表达，3L罐发酵72h，发酵上清液酶活可达988.5U/mL。本工艺采用工业上常用的葡萄糖、棉籽粉、牛肉浸膏、无机盐等原料进行生产，简单易行，适用于大规模生产。

技术领域

本发明涉及一种高产普鲁兰酶的重组短小芽孢杆菌及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

普鲁兰酶是一种能够水解普鲁兰多糖、支链淀粉、α-极限糊精等分子中的α-1,6葡萄糖苷键的淀粉脱支酶。由于糖化酶等对糊精中的α-1，6-糖苷键水解效率很低，往往导致反应时间较长、副产物较多等问题。而普鲁兰酶能快速切割糊精中的分支点，与糖化酶协同作用，可大幅度缩短反应时间，提高原料的转化率。因此被广泛应用于葡萄糖、果糖、麦芽糖、麦芽糊精、低聚糖等产品的生产中。

近年来，对于普鲁兰酶的开发已经成为了研究热点。然而，大部分的研究局限于在大肠杆菌中表达。由于大肠杆菌是一种条件性致病菌，这就极大地限制了普鲁兰酶在食品工业中的应用。虽然也有一些研究者将普鲁兰酶在非致病菌中进行表达，但表达量都很低。例如，张艳等将Bacillus naganoensis来源的普鲁兰酶克隆于枯草芽孢杆菌中，酶活为10.94U/mL，再经刘逸寒等发酵优化，酶活为20.16U/mL；谢银珠等将Bacillusderamificans来源的普鲁兰酶克隆于地衣芽孢杆菌中，经发酵优化，酶活为1.5ASPU/mL。因此，实现普鲁兰酶在非致病菌中过量表达，对普鲁兰酶在食品工业中的应用具有重大意义。

短小芽孢杆菌作为一种宿主菌表达异源蛋白，近年来受到了研究者的关注。首先，它是一种非致病菌，可应用于食品工业；其次，它能过量合成活性异源蛋白，表达量可达1mg/mL以上；再次，它属于革兰氏阳性菌，只有一层细胞膜，蛋白的胞外分泌良好。此外，它还有培养条件简单，生长周期较短等优点，非常适合于表达普鲁兰酶。

发明内容

本发明的目的是提供一种高产普鲁兰酶的重组短小芽孢杆菌。

所述重组菌以短小芽孢杆菌为宿主，通过重组质粒pulA/pSVEB表达来源于脱支芽孢杆菌的普鲁兰酶突变体。

在本发明的一种实施方式中，所述普鲁兰酶是来源于脱支芽孢杆菌的普鲁兰酶(GenBank号为AX203845)的突变体。本发明以普鲁兰酶突变体为例进行说明，保护范围不限于此。

在本发明的一种实施方式中，所述短小芽孢杆菌宿主为Brevibacillus brevisCCTCC AB94025。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒pulA/pSVEB是将缺失了启动子和信号肽的pWB980、普鲁兰酶表达元件、缺失了信号肽的pET20b(+)连接成环得到的；所述普鲁兰酶表达元件包括来源于短小芽孢杆菌的外壁蛋白启动子P2、外壁蛋白信号肽和来源于脱支芽孢杆菌的普鲁兰酶突变体基因。

在本发明的一种实施方式中，所述普鲁兰酶突变体的基因序列与CN201310610426.4中构建的D437H/D503Y/d2突变体的序列一致，为N端的CBM41和X25两个结构域删除了的且发生了D437H和D503Y突变的突变体。

在本发明的一种实施方式中，所述普鲁兰酶表达元件的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。