[发明专利]八角莲的快速繁殖方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特指一种八角莲的快速繁殖方法。

背景技术

鬼臼毒素(Podophyllotoxin，PTOX)是木脂素类化合物中的环木脂内酯，是从鬼臼类植物中提取分离到的一种具有抗肿瘤活性的天然产物，是人工合成依托泊苷(etoposide，VP-16)和替尼泊苷(teniposide，VM-26)等药物的前体。研究表明，鬼臼毒素对于治疗食道癌、子宫癌等顽症具有特效，市场需求十分巨大。随着鬼臼毒素新功能的不断开发和近年来人类患癌率的逐年增加，其市场需求量也将迅速加大。鬼臼毒素主要从小檗科Berberidaceae多年生草本植物如八角莲属、桃儿七属和山荷叶属及足叶草属等中提取，但产量有限。其中，八角莲Dysosma versipellis(Hance)M.Cheng是生产鬼臼毒素的主要传统药源植物。

八角莲是我国传统常用中药之一，具清热解毒，化痰散结、祛痰消肿之功用。长期以来由于过度采挖及其自然繁殖率低，造成野生资源亏缺，物种濒危，目前已被列为国家珍稀濒危三级保护植物。在人工栽培中，由于八角莲座果率低，种子量少，种子萌发的幼苗经过5-6年才能收获，因而限制了八角莲的生产。

对八角莲的研究，过去主要集中于八角莲的分类鉴定、有效成分分析、药理学和栽培学等方面。近年来，黄家云等(2007)诱导八角莲愈伤组织产生丛生芽，并生根形成幼苗。黄家云等(2008)液体振荡培养八角莲愈伤组织，并进行了鬼臼毒素的检测。唐凤鸾等(2008)诱导八角莲种子幼苗形成丛生芽，进而诱导愈伤及根，直接形成再生植株。韦莹等(2011)报道了八角莲愈伤组织的诱导和分化，并成功再生出植株。尽管八角莲的组织培养取得了一定的进展，但诱导的愈伤组织易褐化、分化率低，且易变异，严重影响了通过组培快速繁殖八角莲种苗的生产实践。

体细胞胚胎发生是植物愈伤组织在固体培养基上经过多次继代后，产生分生细胞化，形成胚性愈伤组织；这种组织内的细胞团进一步发展成为胚状体。利用植物能高频率产生胚状体的实验系统，结合在摇床上进行液体培养，同步筛选以获得性状一致的高质量胚状体。通过植物胚性再生植株，具有生长速度快、植株再生频率高、性状稳定等优点，而且可以筛选优良无性系，结合活性成分的筛选，获得活性成分含量高且遗传稳定的植株，这已成为开展植物次生代谢与调控机制的良好受体材料。一些药用植物如黄连(桂耀林等，1989)、檀香(Shekhawat et al.2008)、紫背天葵(郭仰东等，2010)等已成功建立胚性细胞悬浮培养体系。但是，目前除了本实验室的研究成果外，尚无有关八角莲植物体细胞胚胎发生的报道。

发明的内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是为了克服八角莲胚性细胞悬浮培养系的技术空白，提供一种八角莲的快速繁殖的方法，在本发明中，获得的八角莲胚性细胞可以诱导八角莲植株的再生，具有生长速度快、植株再生频率高、性状稳定等优点。

为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种八角莲的快速繁殖方法，包括以下步骤：

步骤一：制作八角莲的无菌外植体；

步骤二：利用诱导培养基培养所述无菌外植体，得到胚性愈伤组织，所述诱导培养基包括MS、0.5～2.0mg/L的2，4-D生长素、1.0～1.5mg/L的木醋液、0.2～0.5mg/L的植物精油和6g/L的琼脂；

步骤三：利用第一增殖培养基培养所述胚性愈伤组织，继代培养2～3代，得到继代愈伤组织，所述第一增殖培养基包括MS、0.5～2.0mg/L的2，4-D生长素、20～25mg/L的水苏糖和6g/L的琼脂；

步骤四：利用分化培养基培养所述继代愈伤组织，得到体胚，所述分化培养基包括MS，0～1.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤分裂素、0.5～2.0mg/L的萘乙酸和6g/L的琼脂；

步骤五：利用第二增殖培养基培养所述体胚，得到继代体胚，所述第二增殖培养基包括MS、0～1.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤分裂素、0.5～2.0mg/L的萘乙酸和0～2.0mg/L的2，4-D生长素；

步骤六：利用植株再生培养基培养所述继代体胚，得到八角莲植株，所述植株再生培养基包括MS、1.0～1.5mg/L的中药粉、1.0～1.4mg/L的赤霉素3，0.2～0.6mg/L的吲哚丁酸、0.3～0.7mg/L的海泡石粉和6g/L的琼脂；