[发明专利]一种真核细胞III型启动子表达CRISPR sgRNA的方法及其应用

说明书

技术领域

本申请涉及基因启动子表达技术，属于生物技术领域。

背景技术

Drosha：一种III型核糖核酸酶，通过识别mRNAs中类似于miRNAs前体的二级茎环结构来定位和切割mRNAs，这在干细胞中抑制基因表达的机制中有重要作用。

在生物体内，miRNA的成熟较siRNA双链的形成过程要复杂，概括为：首先miRNA的前体pri-miRNA在核内由一种称为Drosha酶处理后成为大约70nt的带有茎环结构的PrecursormiRNAs(pre-miRNAs)(Denlietal.,2004；Gregoryetal.,2004；Hanetal.,2004)；这些pre-miRNAs在Exportin-5帮助下转运到细胞核外之后再由胞质Dicer酶进行处理，酶切后成为成熟的miRNAs(Lundetal.,2004；Yietal.,2003)。

CRISPR:规律成簇间隔短回文重复(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)，细菌的II型CRISPR/Cas系统逐渐成为同时打靶多个基因位点的重要工具。

shRNA:shorthairpinRNA,“短发夹RNA”。shRNA包括两个短反向重复序列,克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。在活体中输送“小干扰RNA”(siRNA)的一种办法是，将siRNA序列作为“短发夹”克隆进质粒载体中。当送入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个“双链RNA”(shRNA)，并被RNAi通道处理。

高等生物通常都有复杂的基因网络来确保细胞内的生物活动有条不紊的进行。因此，能够同时打靶多个位点的分子工具对遗传工程的基础研究和实际应用都有巨大意义。近年来，细菌的II型CRISPR/Cas系统逐渐成为达成这一目的的重要工具。从酿脓链球菌中分离得到的Cas9核酸内切酶通过人工修饰的引导RNA(guideRNA，gRNA)的导向作用可以打靶DNA序列的5’-N20-NGG-3’(N代表任何脱氧核苷酸碱基)，N20是与gRNA的5’序列相同的20个碱基，NGG是PAM区(protospacer-adjacentmotif)。Cas9剪切的位点就是PAM附近的区域。这种可以人为修饰的导向RNA和基因组中PAM的高发率使得Cas9-gRNA几乎可以打靶所有的基因元件来实现基因组编辑。正是由于它的简单高效性，基于Cas9的基因编辑工具发展迅速，被用于基因组和表观基因组编辑，转录调控和基因工程的其他应用。

从理论上来讲，多基因编辑可以通过Cas9和靶向不同位点的多个sgRNA一起表达来实现。传统的方法通过显微注射或者表达包含多个单一gRNA(sgRNA)的表达盒来实现。将体外表达的gRNA和Cas9蛋白(或者Cas9的mRNA)注射到细胞或者胚胎只适用于很少的一些系统。因此，最理想的方法就是将多个sgRNA的表达盒压缩到一个载体上。一个典型的sgRNA的表达盒大约是400-500bp，包含RNA聚合酶III(PolIII)的启动子，sgRNA和PolIII终止子。受传递方式和质粒载体承载能力的限制，对于大多数生物来说，用这一sgRNA表达方法同时表达多个sgRNA将是一种挑战。而且，真核生物III型聚合酶转录的RNA需要有一个特定的核苷酸开始，这使得Cas9/gRNA靶位点受限。一个好点的方法就是将多个sgRNA的表达盒压缩到一个合成的基因中，利用一个RNA加工系统从初级转录本中将单个sgRNA分别剪切出来。应用到这一方法的成功案例只有利用Csy4内切核糖核酸酶和tRNA剪切系统。(KabinXie,BastianMinkenberg,YinongYang,BoostingCRISPR/Cas9multiplexeditingcapabilitywiththeendogenoustRNA-processingsystem,PNAS)然而，还需要更有效和精确的方法来同时产生多个sgRNA以提高多基因编辑的能力和充分发挥Cas9系统的应用。