[发明专利]褐斑大蠊分子标准样品及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及褐斑大蠊分子标准样品及其制备方法和应用，属于媒介生物检疫技术研究领域。

背景技术

国内外关于媒介生物分子DNA标准样品的研究则尚处于起步的阶段，很多问题亟待解决。由于受生物发育阶段的限制以及近缘种生物形态的相似性、实际工作中样品的不完整性等原因,传统的形态学手段进行物种鉴定遇到很多实际困难。现有分子DNA技术被证明是一个行之有效的生物鉴定手段。目前，我国还没有经过国家认可的、统一的、规范化的分子DNA标准样品，在国际上也没有该类标准样品。分子生物学鉴定技术是媒介生物分类鉴定新的技术手段。

分子生物学技术可以从分子水平上阐明物种间的差别，如可利用DNA探针技术、DNA测序技术、PCR技术等对媒介生物样品在分子水平上进行分类鉴定。媒介生物分子标准样品可作为实验室对媒介生物进行分子鉴定等技术的参照物，保证测试结果的可溯源性。因此，本项目研制的褐斑大蠊标准样品将为褐斑大蠊分子鉴定工作提供参照和依据，为我国分子标准样品的研究工作起到一定得推动作用。

发明内容

本发明的目的是提供褐斑大蠊分子标准样品，均匀性与稳定性良好，本发明的另一目的是提供褐斑大蠊分子标准样品的制备方法，方法操作简单，易于制备。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：褐斑大蠊分子标准样品，其特征在于：采集褐斑大蠊成虫通过实验室条件饲养后，提取高纯度DNA，进行分装、冻干，得到褐斑大蠊的分子标准品，其具有下述的理化性质：（1）形状：纯白色粉末状；（2）每管的含量1μg±0.1μg；（3）DNA纯度：OD260/280=1.8-2.0；（4）易溶于水或Tris-EDTA（TE）缓冲液中。

进一步地，所述DNA纯度：OD260/280=1.85。

本发明褐斑大蠊分子标准样品的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

第一步为褐斑大蠊DNA提取：

野外采集褐斑大蠊成虫，通过实验室条件饲养，提取褐斑大蠊DNA；

第二步为核酸标准样品的制备：

将测定浓度后的DNA按1μg±0.1μg /管进行分装，每种核酸分子标样分装100管，然后冻干，即为目的标准品。

进一步地，所述第一步中褐斑大蠊DNA提取的具体步骤为：

（1）动物组织裂解：

取2-25mg的动物组织置于2mL离心管中，用剪刀剪成碎块；

加入180μL的Buffer GL、20μL的蛋白酶K（Proteinase K）和10μL的浓度为10mg/mL的RNase A，于56℃水浴中温浴2-3小时，至动物组织完全裂解，后12,000rpm离心2分钟，去除杂质；

（2）向裂解液中加入200μL Buffer GB 和200μL 100%乙醇，充分混匀；

（3）将试剂盒中的离心柱安置于收集管上，将上述操作（2）混合溶液移至离心柱中，12,000 rpm离

心2分钟，弃滤液；

（4）将500μL的Buffer WA加入至离心柱中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液；

（5）在Buffer WB中加入指定体积的100%乙醇，混匀后，将700μL的Buffer WB加入至离心柱中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液；

（6）重复操作步骤（5）；

（7）将离心柱安置于收集管上，12,000 rpm离心2分钟；

（8）将离心柱安置于新的1.5mL的离心管上，在离心柱膜的中央处加入50-200μL的灭菌水或洗脱缓冲液，室温静置5分钟；

（9）12,000 rpm离心2分钟洗脱DNA。

进一步地，所述操作步骤（5）中沿离心柱的管壁四周加入Buffer WB。

进一步地，所述步骤（8）中灭菌水或洗脱缓冲液加热至65℃。

进一步地，对制得的标准样品进行定性鉴定，通过特异性引物进行PCR扩增或测序进行定性分析，来确认所制备的核酸为目的DNA：

取制备的核酸标准样品，加入50μL的TE，溶解后作为模板使用，经采用特异性引物COI-1和COI-2进行PCR并测序，进行定性分析，确认所制备的核酸标准样品为目的核酸样品；

上游引物COI-1: 5’- GGTCA ACAAATCATA AAGATATTGG -3’

下游引物COI-2: 5’- TAAACTTCAG GGTGA CCAAA AAATCA -3’

反应体系：