[发明专利]一种提高脂肪源干细胞抗凋亡及旁分泌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，尤其一种提高脂肪源干细胞抗凋亡及旁分泌的方法。

背景技术

在我国急性心肌梗死的死亡率依然较高。目前对于心肌梗死的治疗方法主要包括溶栓、冠状动脉旁路移植术，经皮腔内冠状动脉血管成形术、激光心肌血运重建术及心脏移植手术等。前四项方法只能恢复梗死区早期再灌注、改善心肌供血，但不能修复或逆转已坏死的心肌，残留心肌只能在有丝分裂信号的刺激下发生肥厚，进而使心室发生重构，最终导致心力衰竭。心脏移植虽可替代受损心脏，但由于缺乏供体，移植后免疫排斥反应及花费较高等原因难以得到广泛应用。因此如何增加梗死区有收缩功能的心肌细胞数量或减少心肌细胞的凋亡或死亡成为治疗心肌梗死的主要障碍。虽然临床实验表明，移植自体细胞可以改善受损心肌的功能，但心肌细胞体外扩增能力有限，难于获取足够数量的细胞，且移植细胞很难弥补和修复先天性或大面积缺损。

干细胞是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的细胞。研究发现脂肪组织中存在一类间充质干细胞，因其克隆细胞株的增殖能力强，具有多向分化的潜能，在体外培养中保持稳定的生长增殖活性，具有与骨髓间充质干细胞一样的多向分化潜能，称为脂肪干细胞。与骨髓间充质干细胞相比，除皮下脂肪含量十分丰富，提取方便外，脂肪干细胞可以分泌具有生物活性的血管内皮生长因子、肝细胞生长因子等多种促进血管新生的因子。

体内各组织器官氧气含量变化范围较大，脂肪组织中氧气浓度一般小于3％，因此脂肪干细胞处于低氧环境中。实验研究表明，低氧环境下培养的脂肪干细胞具有较强的扩增，迁移及抗凋亡能力。Kim等发现活性氧(ROS)，还原型辅酶Ⅱ氧化酶，磷酸化的血小板衍生生长因子-β受到抑制后，脂肪干细胞的扩增与分化能力下降。然后进一步研究发现，中、低量ROS可提高脂肪干细胞扩增，迁移以及再生能力。缺氧条件下，NADPH氧化酶活化使脂肪干细胞产生ROS，定位于细胞核周围的Nox4优先表达，将其沉默后，脂肪干细胞的扩增与迁移能力降低。说明还原型辅酶Ⅱ氧化酶4在脂肪干细胞扩增迁移过程中发挥重要的作用。低氧环境下培养的干细胞，其抗凋亡能力得到改善。Stubbs等应用MTT实验、乳酸脱氢酶实验及Caspase激活实验发现低氧条件下(2％O₂)培养ADSCs24小时后，和常氧条件下培养相比，HP-hADSCs的VEGF分泌量增高，AKT的磷酸化程度也得到提高，进一步研究表明，应用VEGF的中和抗体和磷酸肌醇3-激酶抑制剂LY294002可降低HP-hADSCs的生存能力，说明低氧环境促使ADSCs分泌大量的VEGF，而该细胞因子与ADSCs的存活密切相关。Valorani等的研究结果认为低氧环境(2％O₂)不会改变ADSCs的细胞表型，并且能够提高ADSCs扩增与生存能力，促使其向脂肪细胞与骨细胞分化。不仅如此，ADSCs的扩增与集落形成与低氧环境密切相关(1％O₂)，其机制为低氧环境使得ADSCs的2581个基因受到调控，进而激活了涉及ADSCs增殖与凋亡的相关途径。然而，对于在何种低氧环境下最适于ADSCs旁分泌以及抗凋亡能力还需要进一步的研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种提高脂肪源干细胞抗凋亡及旁分泌的方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种提高脂肪源干细胞抗凋亡及旁分泌的方法，3％低氧环境能促进脂肪源干细胞的抗凋亡及旁分泌能力。

优选的，上述提高脂肪源干细胞抗凋亡及旁分泌的方法，具体方法如下：

(1)剪除脂肪组织中明显的血管，用含有双抗(2ml)的D-Hank’s(200ml)清洗脂肪组织2-3次后剪碎，所述双抗为100U/ml青霉素和1g/ml链霉素；

(2)将剪碎的脂肪组织通过150目尼龙筛网过滤，收集150目滤网上的脂肪组织，用含有40U/50mlDNaseI和250μg/ml两性霉素的D-Hank’s液冲洗滤网上的脂肪组织，去掉分离组织时因破坏细胞而释放的DNA及其他胞内容物；

(3)将脂肪组织加入D-Hank’s液体，并以1500rpm离心5min，将上清转移至离心管中，加入含有0.5％胶原酶I的等体积D-Hank’s液，在37℃恒温振荡器上振荡约75min后，以1800rpm离心5min；