[发明专利]一种筛选天然产物中具有遗传毒性的成分的方法

说明书

技术领域

本发明属于中医药领域，涉及检测天然产物中具有遗传毒性的成分的方法，具体地说本发明涉及一种利用DNA加合物检测发现天然产物中具有遗传毒性成分的方法。

背景技术

DNA加合物是亲电性的化合物或其代谢产物和生物体内DNA分子形成共价相连的化合物，是DNA化学损伤的最重要和最普遍的形式。这种加合物一旦逃避自身的修复，就可能成为致突、致畸、致癌的最小因子。因此DNA加合物的形成被认为是致肿瘤过程的一个重要起始阶段。研究表明许多化学品的致突变、致畸及致癌效应与DNA加合物的形成有关。通过DNA加合物与致突变和致癌关系的研究，人们认识到DNA加合物可能是化学致癌物与癌症之间的一个分子桥梁。

研究DNA加合物有助于理解化学有毒物的致癌致突变的分子生物学机制。另一方面，DNA加合物的发现对于药物的致癌、致突变性来说可能具有早期发现和诊断的意义。目前已被发现产生DNA加合物的成分包括马兜铃酸(AA)和吡咯里西啶生物碱(PAs)等。天然产物中具有繁多的组分，而且大部分组分含量很少，很难通过常规的方法来检测或筛选具有遗传毒性的成分。因此，本领域技术人员致力于开发能够高效地筛选天然产物中具有遗传毒性成分的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种筛选天然产物中具有遗传毒性的成分的方法及其应用。

本发明的第一方面，提供了一种检测天然产物中具有遗传毒性的成分的方法，包括步骤：

配制反应体系并进行温孵反应，所述反应体系包括：待测样本、脱氧核苷和同位素标记的脱氧核苷；

终止反应后，采用高效液相色谱-质谱联用法检测反应体系中DNA加合物的形成。所述方法包括，采用高效液相色谱-质谱联用法获取反应体系中各种物质的分子量；如果在质谱图中存在准分子离子相差为n的物质X和物质X’(即，n＝物质X'准分子离子-物质X准分子离子)，n为脱氧核苷和同位素标记的脱氧核苷的分子量差值，则初步判定该物质X为可形成DNA加合物的成分(即，指示了有遗传毒性的成分)。进一步地，所述方法包括步骤：获取该物质X和物质X’的子离子的准分子离子，如果存在相差为n的物质X的子离子和物质X’的子离子，则可以进一步判定所述物质X为具有遗传毒性的成分。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(1)DNA加合物的初步筛选

配制反应体系，所述反应体系包括：待测样本、肝微粒体(包括肝S9)、脱氧核苷、同位素标记的脱氧核苷和还原型辅酶Ⅱ；

将所述反应体系在37℃条件下孵育进行反应；

反应完成后加入等体积冰乙腈终止反应；

HPLC-MS/MS检测DNA加合物的形成。

在另一优选例中，所述待测样本为天然提取物，所述天然提取物中包含至少1种(优选地≥3种；更优选地≥5种；最优选地≥8种)成分(化合物)。

在另一优选例中，步骤(1)中加入等体积冰乙腈终止反应后，离心、过滤，或经过固相萃取柱等方法进行处理。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤(2)：

(2)配制包括待测样本、肝微粒体(或动物肝S9)、小牛胸腺DNA和还原型辅酶Ⅱ的反应体系；将所述反应体系在37℃条件下孵育进行反应；反应完成后提取DNA；酶解或酸水解，固相萃取，HPLC-MS/MS检测DNA加合物的形成；

所述待测样本为步骤(1)检测获得的能够形成DNA加合物的物质(物质X)。

在另一优选例中，所述步骤(1)的反应体系中，各组分的含量如下：

待测样本浓度≥20μg/ml；肝微粒体蛋白浓度≥0.1mg/ml；脱氧核苷含量≥20μg/ml；同位素标记的脱氧核苷含量≥20μg/ml；还原型辅酶Ⅱ或氧化型辅酶-Ⅱ含量0.5-2.0mmol/L。

在另一优选例中，所述步骤(1)的反应体系中，各组分的含量如下：

待测样本浓度为20μg/ml～5mg/ml(优选为，0.4mg/ml～1.0mg/ml)；肝微粒体蛋白浓度为0.1mg/ml～5mg/ml(优选为1.0mg/ml～3.5mg/ml)；脱氧核苷含量为20μg/ml～5mg/ml(优选为，1.0mg/ml～3mg/ml)；同位素标记的脱氧核苷含量为20μg/ml～3mg/ml(优选为，0.5mg/ml～2mg/ml)；还原型辅酶Ⅱ或氧化型辅酶-Ⅱ含量0.8mmol/L～1.5mmol/L(优选为，1mmol/L)。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，孵育反应时间为1-24h。

在另一优选例中，所述步骤(2)的反应体系中，各组分的含量如下：