[发明专利]用于制备shRNA的引物及制备方法、载体及构建方法

权利要求书

1.一种用于制备shRNA的引物，其特征在于，包括三条引物P1、P2、P3；引物P1长度为34nt，从5’端开始，依次为突出的粘性末端ACCG，21nt的siRNA正向序列，loop序列，以及与siRNA正向序列3’末端3个碱基反向互补的碱基；引物P2，5’端4个碱基由ACCG改变为AAAA，其余序列与P1相同；引物P3是siRNA正向序列5’末端18nt序列的反向互补序列；其中，loop序列为CTCGAG或TTCAAGAGA。

2.一种shRNA的制备方法，其特征在于，采用如权利要求1所述的三条引物退火合成双链shRNA，包括以下步骤：

针对目的基因设计和合成引物后，将引物P1、P2和P3分别稀释为10μM的浓度后，以1:1:2的比例混合，再加入占总体积1/10的1M NaCl进行退火；

将上述混合充分的试剂置于已停止加热的沸水中，然后待其自然降至室温。

3.一种shRNA的表达载体，其特征在于，所述表达载体为慢病毒干扰载体，其中包含shRNA表达框、绿色荧光蛋白表达框；所述shRNA表达框包含shRNA表达启动子，采用如权利要求2所述的shRNA的制备方法制备得到的shRNA，以及致死基因ccdB；所述绿色荧光蛋白表达框包含EF1a启动子和copGFP绿色荧光蛋白表达基因；

所述shRNA表达启动子为启动子U6、H1或7SK之一。

4.一种如权利要求3所述的shRNA的表达载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

制备载体骨架；

在载体骨架上插入shRNA表达启动子；

在载体骨架上插入ccdB序列；

在载体骨架上插入如权利要求2所述的shRNA的制备方法制备得到的shRNA。

5.根据权利要求4所述的shRNA的表达载体的制备方法，其特征在于，制备载体骨架的过程如下：

以pCDF1-MCS2-EF1-copGFP载体为模板，PCR扩增得到EF1a-copGFP片段，用MluI和AfeI双酶切PCR产物，然后插入到同样经过MluI和AfeI双酶切的慢病毒载体pLVX-Puro上，得到载体骨架pLVX-EF1a-copGFP-PGK-Puro；

其中，用于扩增EF1a-copGFP的寡核苷酸引物为EF1a-copGFP-F：5’-CGACGCGTCGAAGGATCTGCGATCGCTCCG-3’；EF1a-copGFP-R：5’-AGCGCTTTAGCGAGATCCGGTGGAGCCGG-3’。

6.根据权利要求5所述的shRNA的表达载体的制备方法，其特征在于，插入shRNA表达启动子的过程如下：

用ClaI和XhoI双酶切载体pLVX-EF1a-copGFP-PGK-Puro，去磷酸后电泳回收；扩增shRNA表达启动子的PCR产物,用ClaI和XhoI双酶切扩增产物；将shRNA表达启动子连接到pLVX-EF1a-copGFP-Puro线性载体的相应位点上，转入大肠杆菌感受态细胞中，涂LB平板，培养过夜，鉴定后得到的载体为pLVX-hU6/H1/7SK-EF1a-copGFP-PGK-Puro。

7.根据权利要求6所述的shRNA的表达载体的制备方法，其特征在于，插入ccdB序列的过程如下：

以pLenti6载体为模板，扩增出含有大肠杆菌ccdB致死基因的片段，将扩增得到的ccdB基因片段用XhoI和Mlu I双酶切后，与经过XhoI和Mlu I双酶切的pLVX-hU6/H1/7SK-EF1a-copGFP-PGK-Puro线性载体连接，转入大肠杆菌感受态细胞中，涂LB/amp平板，培养过夜，进行菌落PCR及酶切鉴定，得到载体pLVX-hU6/H1/7SK-ccdB-EF1a-copGFP–PGK-Puro。