[发明专利]用于制备shRNA的引物及制备方法、载体及构建方法

说明书

本发明公开一种用于制备shRNA的引物及制备方法、载体及构建方法，用于制备shRNA的引物包括引物P1、P2、P3；P1长度为34nt，从5’端开始，依次为突出的粘性末端ACCG，21nt的siRNA正向序列，loop序列，以及与siRNA正向序列3’末端3个碱基反向互补的碱基；P2，5’端4个碱基由ACCG改变为AAAA，其余序列与P1相同；P3是siRNA正向序列5’末端18nt序列的反向互补序列。三条引物长度均不超过35nt，可有效避免长引物合成过程中发生的碱基错误，提高了shRNA的保真性，成本低，适用于高通量制备shRNA。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于制备shRNA的引物及制备方法、载体及构建方法。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种普遍存在于生物体内、序列特异性强、转录后水平的基因沉默机制。目前，采用RNAi技术快速实现生物体内基因沉默已经成为动植物基因功能研究中一种有力的实验工具。

由于动植物体内各自的特点及其RNAi作用机制的差异，当今用于动植物基因功能研究的RNAi的作用分子也有所不同。目前，应用较为普遍的发挥干扰作用的小RNA分子在动物体内主要有siRNA(small interfering RNA)、shRNA(short hairpin RNA)以amiRNA(artificial microRNA)等。而植物体内主要有hpRNA(hairpin RNA)和amiRNA。最早采用RNAi技术研究生物体内基因功能的方法是将体外制备好单链siRNA分子直接注入线虫体内，虽然后来在动植物的基因功能研究中被沿用，但是这种方法的干扰时效性相对较短，为达到有效干扰而提高siRNA浓度又往往有细胞毒性。现在的RNAi技术采用的方法多为构建一个特定的RNAi表达载体，该载体导入动植物细胞后能由RNA聚合酶II型或III型启动子转录出相应的shRNA、amiRNA以及hpRNA(hairpin RNA)等，进而干扰与其靶基因的表达(PlantCell.2006.May；18(5)：1121-33.)。

目前，普遍用于构建shRNA干扰表达载体的方法主要有以下两种：(I)寡核苷酸退火法，普遍做法是化学合成两条特定的寡核苷酸引物，在离体条件下退火形成两端带有黏性末端的双链shRNA片段，然后与经过酶切处理同样带有黏性末端的载体连接转化，得到含有shRNA干扰表达单元的重组质粒。(II)PCR扩增法：设计一对扩增控制shRNA表达启动子的PCR引物，其中正向引物与启动子特异性匹配，反向引物5’末端额外加上针对目的基因的干扰靶序列，将PCR产物克隆到相应的载体上，得到shRNA干扰表达载体(PhysiolGenomics.2007Nov14；31(3)：554-62.)。

以上两种方法虽然都能构建各种RNA干扰表达载体，但也存在不足之处，主要表现在以下几个方面：

一、引物设计过长，容易产生突变，克隆效率低。方法(I)中使用的寡核苷酸单链通常为60-100nt，合成这种长度的寡核苷酸单链不仅合成费用大幅提高，而且碱基合成过程中的错误率也会明显增加，进而增加了重组质粒筛选的工作量，费时费力。二、操作繁琐，不适合高通量构建RNA干扰载体。

以上两类制备shRNA序列的方法，对于构建单个或少数RNA干扰载体虽然可行，但是对于大批量构建RNA干扰载体来讲，工作量大，操作繁琐，效率低下。方法(II)需要在PCR引物中加上针对靶基因的干扰序列，通常需要长引物(通常大于70nt)或者多轮的PCR扩增反应，扩增后的PCR产物也需要经过复杂的双酶切、回收等步骤，因外源片段一般都较小(200bp以内)，回收纯化效率较低，而且载体与非目的片段连接或自连的几率很高，使后续的筛选鉴定过程复杂化，致使工作量增加。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容