[发明专利]脂质体包裹的真核表达质粒pEGFP-IFNα及用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种真核表达质粒，尤其是脂质体包裹的真核表达质粒pEGFP-IFNα，属于生物工程技术领域。

背景技术

随着水产养殖业的发展、高密度养殖技术的普及和养殖产量的迅速增加，水产养殖动物疾病的发生越来越频繁、越来越严重，由此造成的损失逐年增加。每年有1/10的养殖面积受到病害的影响，造成了巨大的经济损失。尤其是鱼类的病毒性疾病，至今都是无法有效控制的世界性难题。病毒性疾病的病原体微小，在宿主细胞内复制，潜伏期长短不一、症状复杂多变、传染性强、死亡率高。迄今已发现的鱼类病毒有70多种，流行比较严重的如草鱼出血病、鲤春病毒血症、传染性造血组织坏死病等。

草鱼作为我国最主要的经济鱼类，其产量约占我国淡水鱼类养殖产量的20%。在其养殖的过程中受到各种病害的威胁，其中以由草鱼呼肠孤病毒（Grasscarpreovirus，GCRV）引起的草鱼出血病最为严重，死亡率高达90%，造成了我国淡水渔业巨大损失。目前，对于鱼类传染性疾病的防治仍然没有很有效的方案。一方面，鱼类病毒病尚无有效的防治药物，使用的化学药剂和抗生素往往会导致药物残留和耐药性的产生，甚至污染水环境。预防水产动物疾病发生流行的有效途径是免疫接种。然而，在病毒疫苗使用过程中，存在很多无法克服的障碍。鱼用疫苗可分为三种类型：第一种为减毒及灭活疫苗；第二种为重组亚单位疫苗和合成多肤疫苗；第三种是核酸疫苗。第一、二种疫苗虽然在生产实践中得到了较大程度的应用，然而在生产成本、效价稳定性、保护力等方面还存在一定的问题。疫苗免疫不适于大面积水面养殖；弱毒疫苗还有毒力返强的潜在危险。近年来，核酸疫苗虽开辟了疫苗学的一个新领域，但是由于免疫效果不稳定，以及免疫机制、安全性问题在理论上还没有解决，因此大大限制了核酸疫苗的推广应用。因此，目前预防和治疗措施仍然不能经济而有效地控制我国疫病的发展，迫切需要找到一种有效的防治措施或治疗方法。

干扰素（interferon，IFN）是最先发现的细胞因子，早在1957年，Issacs等发现，流感病毒处理的细胞产生一种因子，可抵抗病毒的感染，干扰病毒的复制，因而命名为干扰素。是一类具有广泛生物学活性的蛋白质，如抗病毒、抗肿瘤、调节机体免疫反应等，是机体防御系统的重要组成部分。干扰素系统是目前所知的机体防御反应中出现最早的细胞功能调节系统，在病毒感染几小时之内就起作用，并几乎作用于病毒复制的每一阶段。IFN具有广泛的抑制病毒增殖的活性，既可抑制多种RNA病毒，又可抑制多种DNA病毒的增殖，但不同病毒对INF的敏感性不同，相对而言，有囊膜的病毒最敏感。干扰素抗病毒作用表现在病毒繁殖量减少以及减轻细胞的损伤。干扰素系统被激活后，使动物在1-3周时间内对其它病毒的重复感染有抵抗。IFN的抗病毒作用可体现在病毒感染的各个阶段：（1）感染初期：感染细胞IFN的释放与新病毒粒子的产生几乎同时发生，因此在体液免疫和细胞免疫作用之前，IFN反应是限制病毒繁殖和扩散的主要手段。（2）感染扩散期间：血清干扰素在几分钟内扩散到身体的各种器官，而细胞接触干扰素只需几分钟就产生抗病毒状态，并可显著降低病毒血症水平。（3）病毒感染靶器官后：在感染恢复机制中，干扰素是促进感染恢复的重要因子。数十年的研究表明，干扰素系统与免疫系统的关系十分密切，在抗病毒免疫中可互相协调、互相作用。

尽管干扰素具有抗病毒、调节免疫等诸多优点，但是目前对于干扰素的应用主要是在人类疾病上。在水产动物界干扰素的应用不常见，且水产界有关干扰素的应用研究多集中的在Ⅰ型干扰素，对于Ⅱ型干扰素抗病毒作用的研究几乎没有。

发明内容

本发明要解决上述技术问题，从而提供一种脂质体包裹的真核表达质粒pEGFP-IFNα。

本发明解决上述问题的技术方案如下：

脂质体包裹的真核表达质粒pEGFP-IFNα，它是通过以下方法制备的：

（1）、以草鱼RNA为模板，提取总RNA，用反转录试剂盒进行反转录和PCR扩增，制得扩增产物；

（2）、扩增产物纯化，然后再连接到T载体，制得连接产物；

（3）、连接产物转化至大肠杆菌DH5ɑ，获得克隆产物；

（4）、对克隆产物用XhoⅠ、HindⅢ进行双酶切，酶切产物回收IFNα片段，插入真核表达载体pEGFP-N1的多克隆位点，转化大肠杆菌DH5ɑ，然后抽提质粒进行酶切；得到重组质粒pEGFP-IFNα；