[发明专利]一种重组酶复合物及体外同源重组无缝克隆的方法

权利要求书

1.一种微生物体外同源重组无缝克隆的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤一：制备线性化克隆载体；

步骤二：制备插入片段PCR产物，通过在引物5’端引入所述线性化克隆载体的末端同源序列，使得所述插入片段PCR产物的5’端和3’端分别带有和所述线性化克隆载体两个末端对应的完全一致的序列，其中，PCR产物末端同源序列的长度为15bp-20bp；

步骤三：将步骤一中获得的所述线性化克隆载体与步骤二中获得的所述插入片段PCR产物在重组酶复合物的作用下进行重组反应，重组酶复合物来源于大肠杆菌Rec同源重组酶，所述重组酶复合物包括RecE、RecT和Gamma蛋白，所述RecE、所述RecT和所述Gamma蛋白三种重组酶的含量比例为1:1:2；当所述插入片段PCR产物大于等于5kb时，所述线性化克隆载体与所述插入片段PCR产物摩尔比为1:10；当所述插入片段PCR产物小于等于2kb时，所述线性化克隆载体与所述插入片段PCR产物摩尔比为1:2；

步骤四：将步骤三中获得的重组产物进行细胞转化，获得转化细胞；

步骤五：将步骤四中获得的所述转化细胞进行培养，并进行克隆鉴定，得到经所述克隆鉴定为阳性的重组DNA分子。

2.根据权利要求1所述的微生物体外同源重组无缝克隆的方法，其特征在于，所述步骤一中，所述线性化克隆载体通过限制性内切酶酶切或反向PCR扩增获得。

3.根据权利要求2所述的微生物体外同源重组无缝克隆的方法，其特征在于，所述限制性内切酶酶切是单酶切或双酶切。

4.根据权利要求2所述的微生物体外同源重组无缝克隆的方法，其特征在于，采用所述反向PCR扩增的方法时，使用高保真聚合酶对预线性化的克隆载体进行扩增。

5.根据权利要求1所述的微生物体外同源重组无缝克隆的方法，其特征在于，所述步骤二中，所述引物的设计方式如下：

正向扩增引物设计方式：

5’—上游载体末端同源序列+基因特异性正向扩增序列—3’；

反向扩增引物设计方式：

3’—基因特异性反向扩增序列+下游载体末端同源序列—5’。