[发明专利]一种重组酶复合物及体外同源重组无缝克隆的方法

说明书

本发明涉及一种重组酶复合物，该重组酶复合物来源于大肠杆菌Rec同源重组酶，包括RecE、RecT和Gamma蛋白。本发明还提供了一种体外同源重组无缝克隆的方法，只需将两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合，在该重组酶复合物的催化下，高效率地将目标DNA定向克隆到任意载体的任意位点，克隆阳性率可高达95％以上。本发明的方法尤其适用于DNA大片段的克隆。本发明弥补了传统克隆方法操作繁琐、费时、失败率较高等缺陷，可以为DNA体外重组提供一种快速便捷高效的克隆方法，在细胞学基础研究和工农业生产、医药保健等方面奠定重要的基础。

技术领域

本发明涉及的是分子生物学中的DNA重组技术，具体涉及的是一种体外同源重组的核酸分子克隆方法及一种重组酶复合物。

背景技术

现代生物学研究在很大程度上要依赖于重组DNA技术。细胞内发生的DNA重组现象，称为体内重组。由于新技术的发展，现在可以由人工操作在细胞外进行DNA重组，称为体外重组。

通过DNA的重组获得基因的克隆是研究基因的结构、功能及演化的基础。基因克隆技术，又被称为分子克隆技术、重组DNA技术、基因工程、基因操作或基因的无性繁殖等。在整个基因克隆的过程中，DNA的重新组合是一个十分关键的步骤，它直接决定着整个克隆的成功与否。随着时间的推移，研究的深入，越来越多的DNA重组方法被应用到生产和科研当中。

传统的酶切-连接经典克隆方法产生于20世纪70年代初，是最早应用的基因克隆方法，是比较通用且常用的方法，一直沿用至今。但是在实际的实验过程中，这种方法的步骤显得较为繁琐费时，需要根据克隆基因序列选择不同的内切酶使用，成本较高。且部分富含特殊回文序列的基因克隆常因无合适内切酶位点而失败。

因此开发一种操作简便高效快速的体外重组克隆技术以替代传统的酶切连接方法具有重要意义。

发明内容

为实现上述目的，本发明提供了一种重组酶复合物，该重组酶复合物来源于大肠杆菌Rec同源重组酶，包括RecE、RecT和Gamma蛋白，其中Gamma蛋白的NCBI Gene ID:8183641。

进一步地，RecE、RecT和Gamma蛋白三种重组酶的含量比例为1:1:2。

本发明还提供了一种体外同源重组无缝克隆的方法，该方法包括以下步骤：

步骤一：制备线性化克隆载体；

步骤二：制备插入片段PCR产物，通过在引物5’端引入该线性化克隆载体的末端同源序列，使得该插入片段PCR产物的5’端和3’端分别带有和该线性化克隆载体两个末端对应的完全一致的序列；

步骤三：将步骤一中获得的线性化克隆载体与步骤二中获得的插入片段PCR产物在该重组酶复合物的作用下进行重组反应；

步骤四：将步骤三中获得的重组产物进行细胞转化，获得转化细胞；

步骤五：将步骤四中获得的转化细胞进行培养，并进行克隆鉴定，得到经克隆鉴定为阳性的重组DNA分子。

进一步地，步骤一中，该线性化克隆载体通过限制性内切酶酶切或反向PCR扩增获得。

进一步地，限制性内切酶酶切是单酶切或双酶切。

进一步地，采用反向PCR扩增的方法时，使用高保真聚合酶对预线性化的克隆载体进行扩增。

进一步地，步骤二中，引物的设计方式如下：

正向扩增引物设计方式：

5’—上游载体末端同源序列+基因特异性正向扩增序列—3’；

反向扩增引物设计方式：

3’—基因特异性反向扩增序列+下游载体末端同源序列—5’。