[发明专利]儿茶酚-O-甲基转移酶的特异性荧光探针及其应用

说明书

一种儿茶酚‑O‑甲基转移酶的特异性荧光探针及其应用。该特异性探针底物为3‑苯并噻唑‑7,8‑二羟基香豆素(3‑BTD)，该底物可被COMT酶专一性催化生成8‑甲氧基产物并在520nm处显示荧光信号，通过检测荧光强度的变化可定量测定COMT的活性。该探针不仅可用于不同来源生物样本中COMT酶活的定量评估，还可用于体外快速筛选COMT的抑制剂并评估其抑制能力。该方法可用于各类体外生物样品中COMT酶真实活力的定量评估，实现抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价；可用于评价不同种属COMT及具有不同氨基酸序列的COMT突变体的催化活性，进而评估其代谢儿茶酚类药物的能力。具有灵敏度高、准确度高、抗环境干扰能力强、易于高通量检测与抑制剂筛选等优势。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种儿茶酚-O-甲基转移酶特异性荧光探针及其应用。

背景技术

儿茶酚-氧-甲基化转移酶(Catechol-O-methyltransferase,COMT)是人体中重要的一种Ⅱ相转移酶，广泛分布于人体组织如肝脏，肾脏，肺，乳腺，血红细胞及大脑中。在人体中COMT负责清除活性及毒性的儿茶酚类化合物，如神经递质多巴胺，肾上腺素及去甲肾上腺素，以及儿茶酚雌激素类化合物如雌二醇等(Pharmacol Rev.1999；51(4):593-628)。另外，COMT酶还参与外源性的儿茶酚类药物(如卡比多巴，苄丝肼，阿扑吗啡，多巴酚丁胺，非诺多泮，α-甲基-L-DOPA，异丙肾上腺素和利米特罗等)的代谢清除。

人体中COMT酶呈基因多态性，根据其基因型不同分别表现为低活性(COMT^LL)，中等活性(COMT^LH)和高活性(COMT^HH)，低活性和高活性之间有最高4倍的差异。而大量临床样本分析已证实，人体组织中COMT水平与精神分裂症，乳腺癌等都有较高的相关性。当人脑中的COMT活性偏高时，大脑中前额叶皮质突触间隙中的多巴胺分解代谢增加，大脑认知能力受损，导致精神分裂症的发生风险增加(PNAS.2001；98(12):6917–22)；而当人乳腺中COMT活性偏低时，雌二醇等雌激素无法代谢，其高暴露直接导致乳腺癌的发生(Cancer Res.1998；58(10):2107-10)。临床实践已证实，人体组织中COMT含量的定量测定对于临床相关疾病的早期诊断以及疾病的愈后跟踪都有十分重要的参考价值。由于精神分裂症的临床症状复杂，而其疾病标志物的缺乏导致临床诊断的难度增加(J Clin Psychiatry.2005；66(2):183-194)；此外，乳腺癌是世界范围内发病率最高的癌症之一，也由于缺少明确的诊断指标，为疾病的及早发现与治疗造成极大障碍。另外，COMT还是帕金森病治疗的一个重要靶点(CNS Drug Reviews.2007；13(3):352–379)，利用探针反应并借助体外代谢孵育体系可高通量的筛选和评价COMT抑制剂，对于帕金森病治疗药物的发现意义重大。同时，具有高活性COMT的帕金森患者在左旋多巴治疗时，“开-关”波动效应更明显(J.Neural Transm.2000,107:105-111)，因此COMT活性高低定量评判对于不同患者中左旋多巴的剂量调整具有重要的指导作用。

目前常用的COMT酶的探针底物主要有左旋多巴，多巴胺以及肾上腺素等儿茶酚胺类化合物，但这些底物的化学稳定性较差，需要加入还原剂以及避光操作。此外，上述底物在哺乳动物COMT酶的催化下都生成两个单甲基化产物，在实际检测中需要将两个同分异构体实现分离后方可进行定量分析。更为重要的是，上述底物及其代谢产物只能通过质谱分析进行定量检测，且两个产物由于结构和理化性质相近，在液相色谱上通常难以分离；加之该类化合物稳定性差、样品前处理复杂，给其定量检测带来了不便。因此，急需开发一种高效、灵敏且可定量检测人体组织中甲基化酶活性的方法。

目前，COMT的体外评价体系主要包括哺乳动物的红细胞，以及亚细胞组分等，其中亚细胞组分主要包括肝脏组织的S9、胞浆以及脑组织匀浆等成分。采用这些标准化的评价体系，结合相应的辅因子(S-腺苷甲硫氨酸)和孵育条件，可通过检测探针底物的代谢清除或产物生成速率，对上述各种体系中表达的COMT酶活性进行表征。