[发明专利]一种基于凝胶色谱柱检测多溴联苯醚羟基代谢物的方法

权利要求书

1.一种基于凝胶色谱柱检测多溴联苯醚羟基代谢物的方法，所述凝胶色谱柱为采用如下方法制备的凝胶色谱柱：(1)、称取聚苯乙烯凝胶和溶剂，其中每1克聚苯乙烯对应量取5～8毫升溶剂，所述的溶剂为环己烷和乙酸乙酯的混合溶液，将聚苯乙烯凝胶混合于溶剂中，摇匀，然后进行溶胀，溶胀时间大于24小时，溶胀平衡后，倒出上清液以及悬浮颗粒杂质，备用；

(2)、取一支干燥洁净的色谱柱以及一支硅胶软管，将硅胶软管连接在色谱柱的下端出口处，然后向色谱柱内加入占柱体积20～30％的溶剂，静置，直至色谱柱内的玻璃砂芯滤板中无气泡溢出，然后打开活塞，挤压硅胶软管，排出玻璃砂芯滤板下方和活塞之间的气泡，使溶剂充满此部分空间，然后关闭活塞；

(3)、将溶胀后的聚苯乙烯凝胶和溶剂倒入烧杯中，充分搅拌直至聚苯乙烯凝胶均匀的悬浮在溶剂中，制得凝胶悬浮液，然后将凝胶悬浮液由色谱柱的顶端倒入于色谱柱中，使凝胶悬浮液自然沉降，当色谱柱底部的凝胶悬浮液沉积至1/5柱体积时，打开色谱柱下端活塞，并调节流速至2～3mL/min，然后继续倒入凝胶悬浮液至柱体积5/6处，并保持凝胶始终浸泡在溶剂中，待凝胶完全沉降均匀后，在凝胶层之上加入1/12柱体积的海沙，铺平，即制得所述凝胶色谱柱；

其特征在于：所述检测多溴联苯醚羟基代谢物的方法包括以下步骤：(1)、将待测样品与硅藻土按照1:8～10的体积比混合，再用环己烷和乙酸乙酯按照1:1的体积比混合后的溶液进行洗脱，收集并浓缩待测样品洗脱液，制得浓缩液A；

(2)、在浓缩液A中加入内标碳13标记内标4′-OH-BDE-17、3′-OH-BDE-28、2′-OH-BDE-28、4′-OH-BDE-49、6-OH-BDE-47、2′-OH-BDE-68、6-OH-BDE-85、5′-OH-BDE-99、4′-OH-BDE-101、3′-OH-BDE-154和4-OH-BDE-187的混合标准溶液，浓度为100ng/mL；将以上物质加入浓缩液中并混合均匀，再将浓缩液注入色谱柱内，直至浓缩液的液面与海砂面平齐；

(3)、采用1.2～1.4倍柱体积的环己烷和乙酸乙酯进行洗脱，洗脱流速为1.00～1.50mL/min，弃去前50～60％柱体积的洗脱液，收集剩余部分的洗脱液于蒸发瓶中，后续经旋转蒸发与氮吹浓缩至0.9～1.1mL，制得浓缩液B，供LC-MS检测用；

(4)、将浓缩液B注入LC-MS中，采用C18液相色谱柱，流动相采用溶剂Ⅰ乙腈和溶剂Ⅱ水组成，梯度淋洗条件为溶剂比Ⅰ:Ⅱ由50～60:40～50至70～80:20～30，在前18～22分钟，流速为0.35～0.40mL min^-1；在运行前，柱平衡4～6分钟，柱温设置为38～42℃，柱进样体积为8～12μL，质谱检测器采用负离子电喷雾离子源ESI，多反应监测模式；气帘气，雾化气、碰撞气均为氮气；流速为4～6L/min，温度为340～360℃，保护气流速为10～12L/min，温度为380～420℃；毛细管和喷嘴电压分别为3300～3600V和450～550V；喷雾器压力和电子倍增电压分别设置为45～55psi和750～850V；每个多反应监测转换的停留时间为18～22ms；

(5)、采用同位素稀释内标法定量，即以待测物浓度为横坐标，待测物峰面积与相应的同位素峰面积之比为纵坐标，得到工作曲线，从而计算待测样品中4′-OH-BDE-17、3′-OH-BDE-28、2′-OH-BDE-28、4′-OH-BDE-49、6-OH-BDE-47、2′-OH-BDE-68、6-OH-BDE-85、5′-OH-BDE-99、4′-OH-BDE-101、3′-OH-BDE-154和4-OH-BDE-187的含量。