[发明专利]一种兼性需氧菌的简易批量培养方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种兼性需氧菌的简易批量培养方法。

背景技术

发酵是指人们借助微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体本身、或者直接代谢产物或次级代谢产物的过程（邱立友，王明道主编 ．微生物学 ：化学工业出版社 ，2012 ：343 ）。随着生物技术的不断发展，在微生物发酵领域对兼性需氧菌的纯培养需求日益增多，目前，兼性需氧菌的实验室培养是一种常见、简单、成熟技术，如液体、固体培养；试管、平皿、茄形瓶培养等，但大批量生产制备，其工艺难度较大。在大批量兼性需氧菌的纯培养发酵领域，多采用传统的发酵罐液体通气培养方法，该方法普遍存在生产环节易污染、生产效率较低、菌液浓缩困难、污水排放多及生产成本高等瓶颈。

密封箱体多层固体发酵培养方法，其设备简单、成本低廉、操作方便、不易污染、生产效率高；该技术的应用可显著降低培养基的用量，节约产品浓缩成本，降低能耗，减少污水排放。与传统发酵罐液体发酵培养方法相比，其培养效率可提高50倍以上，细菌浓度可高达1500 ~2000亿个/ml，降低生产成本50%以上。

经百度搜索引擎、维普中文科技期刊数据库等搜索“固体平面发酵”、“固体平面培养”、“多层方盘发酵培养”等词汇，均未查阅到相同或相近的内容。现行的微生物固体发酵培养，是在本领域广泛应用的传统技术、方法，其工艺特征在于混菌发酵培养，即微生物与固体培养基颗粒混合在一起。本专利技术提供的密封箱体多层固体培养方法，工艺特征是浓缩纯培养，即单一细菌的纯化培养。细菌的批量纯化培养在许多生物技术领域如菌种生产、疫苗生产、微生态制剂和生物酶制剂生产等都有着广泛的技术需求。

发明内容

本发明的目的在于针对在兼性需氧菌的批量生产制备过程中普遍存在生产效率低、菌液浓缩困难、污水排放多或生产成本高等瓶颈问题，提供一种兼性需氧菌的简易批量培养方法，该培养方法设备简单、成本低廉、操作方便、不易污染、生产效率高，与传统发酵罐液体发酵培养方法相比，其培养效率可提高50倍以上，细菌浓度可高达1500~2000亿个/ml，降低生产成本50%以上。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种兼性需氧菌的简易批量培养方法，采用密封箱体多层方盘固体平面发酵装置培养；所述的密封箱体和方盘是以不易变形的耐热薄板材质制作，方盘的数量为10~20个，密封箱体的大小以仅能容纳指定数量层叠放置的方盘为准，密封盖的对角处分别设置2个直径为22mm的接种孔，接种孔用硅胶塞密封；所述密封箱体开口处设有封闭开口的密封盖，所述密封盖与箱体开口边缘之间设有密封胶垫，所述密封盖、密封胶垫及箱体经贯穿三者的锁闭螺丝固定连接；锁闭螺丝设置于密封盖四角。

所述的不易变形的耐热薄板材质是不锈钢。

每个方盘的尺寸根据生产需求进行设定，如根据生产需求设置为：长45㎝~60㎝；宽30㎝~45㎝；高1.5㎝~2.5㎝。

所述的兼性需氧菌的简易批量培养方法，包括以下步骤：

1）通过密封盖上预留的接种孔，注入按方盘内表面积计算能形成厚度为3mm~5mm凝胶的琼脂培养基混悬液，用硅胶塞密封接种孔，置高温灭菌设备中常规灭菌，待箱体温度降至50℃~60℃，震荡箱体混匀培养基，以方盘位置为基准竖立箱体，静置片刻使琼胶从缝隙中流入方盘，待琼胶液面平衡稳定，然后快速水平放置箱体并使方盘开口朝上，使融化的琼脂均匀分布于每个方盘中；

2）待琼脂降温凝固，按箱体容积的1%~2%接种液体菌种，接种采取无菌术式，借助超净工作台或火焰封闭将菌种注入或滴入接种孔中，菌种浓度保持5亿个/ml以上，接种后以方盘位置为基准竖立箱体，静置片刻使菌液从缝隙中流入方盘，待菌种液面平衡稳定，然后快速水平放置箱体并使方盘开口朝上，轻轻倾斜、往返震荡箱体，使菌种充分涂布于琼脂培养基表面，置适温条件下培养24 h~72 h形成菌苔；

3）培养物收获时按箱体容积的15%~20%注入冲洗液，震荡箱体充分洗涤菌苔后倾斜箱体，通过接种孔导出洗涤液即获得浓缩纯培养菌液。

所述的兼性需氧菌的简易批量培养方法，细菌在多层方盘固体培养基上发酵培养，采用一次性注入培养基、一次性灭菌、一次性形成多层培养表面、一次性接种、一次性洗涤收获。

为防止产品污染，通过无菌操作采用注射针头、胶管连接和过滤空气箱体内增压的方法，将浓缩菌液导入容器中，获得无污染的浓缩纯培养菌液。

箱体中残留的培养基，通过加热或高温灭菌后，在培养基降温凝固前通过接种孔倒出，注水冲洗，将接种孔倒置、淋干备用。