[发明专利]热休克蛋白基因启动子和四环素基因启动子控制的多基因表达和沉默系统

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种热休克蛋白基因启动子和四环素基因启动子控制的多基因表达和沉默系统。

背景技术

在研究一些特定基因如与细胞生长、发生、发展密切相关的基因时，由于不能精细调控目的基因的表达程度可能同时会影响正常细胞的生长、增殖，因此可调控，可诱导系统被认为是未来基因治疗的重要发展方向。诱导型表达载体可以通过诱导型启动子来调节基因表达，进而实现目的基因的定时定量诱导表达。目前应用的诱导体系有cre2loxP系统，四环素诱导体系，蜕皮素诱导体系，热休克诱导体系和乳糖诱导体系。其中，四环素调控表达系统(tetracycline expression system)包括Tet-on和Tet-off系统。Tet-off基因表达系统包含有2个调控元件：TRE启动子包含有四环素操纵基因TetO(tet operator，TetO)的42个碱基的7次正向重复序列；杂合的四环素调控的转录活化因子(tetracycline-controlled transcriptional activator，tTA)，称四环素调节转录因子(tTA)，该因子可与反应转录的四环素反应元件(Tet-responsive element，TRE)结合，在没有四环素(tetracycline)或其衍生物强力霉素(Doxycycline)存在的情况下，引起插入启动子下游的目的基因或shRNA的高效表达。TRE启动子包含人巨细胞病毒的最低限度启动子(minimal CMV promoter，PminCMV)，其特点是启动子缺少增强子，不能单独启动外源基因表达，由于增强子的缺失，在无转录调控部分与它结合时，因而不会有外源基因的表达。通过改变tTA的氨基酸顺序构建了受四环素正调节的基因表达系统，称为Tet-on基因表达系统。该系统在没有四环素及其衍生物强力霉素(Doxycycline，Dox)的情况下目的基因表达水平为零或者很低，而在加入四环素衍生物强力霉素(Doxycycline，Dox)后目的基因高效表达。在该系统中，通过突变氨基酸残基就得到了四环素调控的反式激活子(reverse tet-controlled transactivator，rtTA)，当无Dox存在时，它不能识别其特异的DNA靶序列(TetO)，故不能进行转录；当有Dox存在时，rtTA构象发生改变，接着与TetO反应元件结合启动转录，由于加入四环素促进基因的表达，因此称之为“Tet-on”；

而热休克蛋白HSP70是热休克蛋白家族中的一员，是从细菌到哺乳动物广泛存在的一类热应急蛋白质。当有机体暴露于高温的时候，就会由热激发合成此种蛋白，来保护有机体自身。许多热休克蛋白具有分子伴侣活性。许多小分子热休克蛋白基因一般并不表达，显著表达小分子热休克蛋白一般是细胞受到外部刺激的时候，比如高温刺激。当将生物的整体、组织、细胞等从其生活的温度范围内急剧地从低温移向高温时，可显著地降低一些蛋白质的合成；与此相反，休克蛋白的合成却反而被促进。经研究发现，热休克蛋白启动子中存在有一种热休克元件(HSE)，能够感受温度范围的变化，在高温环境下，HSE元件被激活，进而激活热休克蛋白启动子，热休克蛋白得以表达。因此含有热休克元件(HSE)的Hsp70启动子，可以实现温度诱导的基因表达。另外，过高热是通过微波无线电频率杀死肿瘤细胞的有效方法，同时，过高热具有准确的定位和无副作用的优点。因此热休克系统可运用到肿瘤的临床治疗中。

目前诱导型表达载体已应用到肿瘤基因治疗相关研究中，如结肠癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌等癌症的细胞体外研究和实验动物的体内研究已经卓有成效，为肿瘤的基因治疗提供了新的思路。但是当前可调控系统存在以下主要缺陷：(1)漏表达(leaky expression)，即在调控抑制状态下存在不同程度目的基因的表达，形成背景噪音，由于哺乳动物的基因系统是复杂的多级、多途径环路，基础表达不可避免；(2)在肿瘤治疗的基因中，往往单个治疗起不到很好的治疗效果，而多靶点的基因治疗能获得更好的疗效，传统的控制系统都是单个诱导控制系统，无法实现多基因靶点的可调控控制，传统多基因的表达往往采用质粒共转染的方法，而共转染导致基因表达效率低，无法很好的满足实验要求；(3)传统的单个诱导控制系统在遇到两个基因都需要同时协调控制的情况时，无法满足实验的需要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种热休克蛋白基因启动子和四环素基因启动子控制的多基因表达和沉默系统，在同一个质粒系统中热休克蛋白基因启动子与四环素基因启动子之间既可以互不干扰，独立工作，也可以实现基因共表达。