[发明专利]一种基于CRISPR的大肠杆菌O157:H7菌株检测试剂盒及检测方法在审
| 申请号： | 201510514478.0 | 申请日： | 2015-08-20 |
| 公开（公告）号： | CN105112519A | 公开（公告）日： | 2015-12-02 |
| 发明（设计）人： | 段广才;梁文娟;张荣光;杨海燕;张卫东;郗园林;范清堂 | 申请（专利权）人： | 郑州大学 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/19 |
| 代理公司： | 郑州睿信知识产权代理有限公司 41119 | 代理人： | 牛爱周 |
| 地址： | 450001 *** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 基于 crispr 大肠杆菌 o157 h7 菌株 检测 试剂盒 方法 | ||
1.基于CRISPR的大肠杆菌O157:H7菌株检测试剂盒，其特征在于：包含针对大肠杆菌O157:H7菌株的CRISPR1位点基因序列或其同源性达95％以上的同源序列设计的引物；所述引物如下所示：
上游引物：5’-GTTATGCGGATAATGCTACC-3’，
下游引物：5’-CGTAYYCCGGTRGATTTGGA-3’，Y为C或T，R为A或G。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：还包含2×TaqPCRMasterMix、灭菌超纯水及DNAMarker2000。
3.基于CRISPR的大肠杆菌O157:H7菌株检测方法，其特征在于：包括以下步骤：以大肠杆菌基因组DNA或菌液为模板，利用上、下游引物进行PCR扩增，测序并分析PCR扩增产物，检测出CRISPR1的3条独特的间隔序列即为细菌阳性，3条独特的间隔序列如SEQIDNO.5，SEQIDNO.6，SEQIDNO.7所示；
所述上、下游引物为：
上游引物：5’-GTTATGCGGATAATGCTACC-3’，
下游引物：5’-CGTAYYCCGGTRGATTTGGA-3’，Y为C或T，R为A或G。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为：8μmol/L上游引物1μL，8μmol/L下游引物1μL，2×TaqPCRMasterMix12.5μL，大肠杆菌基因组DNA模板2μL，灭菌超纯水8.5μL，总计25μL。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为：8μmol/L上游引物1μL，8μmol/L下游引物1μL，2×TaqPCRMasterMix12.5μL，单菌落，10×PCR菌落增强剂用灭菌超纯水稀释成10倍后加至25μL。
6.根据权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于：94℃预变性2min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，共10个循环；变性和退火条件不变，每个循环其延伸步骤延长10s，共25个循环；72℃继续延伸10min。
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