[发明专利]一种利用荧光PCR技术对小鼠的分型鉴定方法

权利要求书

1.一种利用荧光PCR技术对小鼠的分型鉴定方法，包括：

(1)利用Crispr/Cas9系统敲除mircoRNA的C57BL/6J小鼠，得到Founder小鼠；将Founder小鼠与C57BL/6J小鼠杂交，得到F1代小鼠，F1代杂合小鼠得到F2代；其中，mircoRNA为mircoRNA505；

(2)分别取上述F1、F2代小鼠尾组织，然后提取DNA；

(3)在Crispr/Cas9系统敲除的基因位点区域设计一对PCR引物，且在上游引物的5’端使用FAM荧光修饰，得到荧光引物；其中，引物为：L：5’AAACCAGCAAGTGTTGACGC3’；R：5’CCCTGTTTGTCACTTGCAGA3'；

(4)将荧光引物对步骤(2)中的DNA进行PCR扩增，然后将PCR产物与分子内标混合，在测序仪上经过电泳分离，鉴定；其中，在测序仪上经过电泳分离为：在377测序仪上经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，测试仪功率为30W，分离时间为2h；分子内标为携带ROX的已知片段大小的DNA，其中已知片段大小的DNA的片段大小为79、105、131、151；

鉴定具体为：将测序仪上电泳分离的结果进行数据采集，然后对采集的数据进行分析，分析PCR产物检测峰的数目及位置，计算出PCR产物大小，进行鉴定；检测峰的数目：单峰为纯合，双峰为杂合；检测峰的位置：峰的位置代表产物片段大小；野生老鼠产物大小为112bp，检测峰位于右侧，为单峰；双敲小鼠产物大小为89bp检测峰位于左侧，为单峰；单敲小鼠产物大小为89bp，左侧峰，112bp为右侧峰，为双峰。

2.根据权利要求1所述的一种利用荧光PCR技术对小鼠的分型鉴定方法，其特征在于：所述步骤(3)中FAM为6’FAM。

3.根据权利要求1所述的一种利用荧光PCR技术对小鼠的分型鉴定方法，其特征在于：所述步骤(4)中PCR扩增具体为：3μLDNA加入到Taq酶体系中，其中Taq酶体系包含1.5μL200nM上下游引物、1.5μL 0.25mM的dNTP，5μL 10XPCR Buffer，1μL的1单位Taq酶，并使用矿物油覆盖；同时设阴性对照，反应程序为：95℃变性5min；94℃变性30s，56℃复性1min30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃，10min。