[发明专利]一种利用荧光PCR技术对小鼠的分型鉴定方法

说明书

本发明涉及一种利用荧光PCR技术对小鼠的分型鉴定方法，利用荧光PCR引物，经PCR扩增后将产物与已知片段大小的ROX混合，利用377测序，使用Genemapper软件计算出PCR产物的大小，从而达到鉴定小鼠基因型的目的，即可。本发明简单直接准确的鉴定出Crispr/Cas9敲除的mircoRNA小鼠。

技术领域

本发明属于小鼠分型鉴定方法领域，特别涉及一种利用荧光PCR技术对小鼠的分型鉴定方法。

背景技术

基因打靶技术自诞生以来一直是研究基因功能的重要手段之一，揭示了许多重要基因的生物学功能。除此之外，研究人员也憧憬能利用基因打靶技术对特定基因进行敲除或者修饰，从而达到治疗疾病或者改善畜禽生产性状的目的。但早期基因打靶技术效率极低，难以真正应用到医疗或者畜禽改良实践中。CRISPR/Cas9系统作为一种新兴的基因定点编辑技术逐渐成熟并在多个动植物物种中成功得到应用,极大地促进了基因功能的研究。CRISPR/Cas系统广泛分布于细菌和古生菌基因组中,是在进化过程中形成的一种适应性免疫系统,可以降解入侵病毒或质粒DNA。

CRISPR/Cas系统的出现为基因工程提供了一个强有力的应用新工具,它将给基因组定向编辑的研究和应用领域带来突破性的技术革命,特别是在基因功能解析、人类疾病靶向治疗等应用中有巨大的潜力和广阔的前景；有望加速重要农作物水稻、小麦性状改良与分子定向育种。更令人鼓舞的是,其操作简单、实验周期短、节约成本，有利于在普通实验室推广这一技术,因此,CRISPR/Cas系统的广泛应用将对生物学研究产生深远的影响。利用Crispr/Cas9技术的基因敲除小鼠也越来越多，传统的对敲除小鼠进行的分型的方法是通过T7E1酶切来鉴定。这种方法首先通过PCR技术扩增出大量的需要鉴定位点的模板，再通过一个退火的过程会在杂合链上形成一个缺口，最后使用T7E1酶切并观察琼脂糖电泳PCR产物条带来鉴定小鼠的基因型。然而，这种方法过于繁琐，需要经过一段时间退火才可以进行下一步实验；使用酶切方法，如果酶切的效率低也会产生假阴性的结果；使用琼脂糖电泳，分辨率较低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用荧光PCR技术对小鼠的分型鉴定方法，经过PCR扩增后通过产物大小及峰图直观分辨小鼠类型。

本发明的一种利用荧光PCR技术对小鼠的分型鉴定方法，包括：

(1)小鼠饲养和样本采集：

SPF级C57BL/6J小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)，SPF级利用Crispr/Cas9系统敲除mircoRNA的C57BL/6J小鼠(中科院实验动物中心构建)，得到的小鼠为Founder小鼠；

将2只Founder小鼠与C57BL/6J小鼠杂交，得到F1代小鼠，F1代杂合小鼠得到F2代；

(2)DNA抽取：取上述F1代小鼠1cm尾组织(－20℃保存备用)，然后提取DNA；

采用动物基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程有限公司)，按照说明书进行抽提得到DNA，以0.8％琼脂糖凝胶电泳确定DNA质量和浓度；

(3)引物设计：

在Crispr/Cas9系统敲除的基因位点区域设计一对PCR引物(根据NCBI数据库中C57BL/6J小鼠的microRNA的序列，使用Primer3在线软件(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)进行初步引物设计，再利用oligo6人工设计，然后合成(上海生工生物工程技术服务有限公司))，且在上游引物的5’端使用FAM荧光修饰，得到荧光引物；

(4)荧光PCR技术鉴定：

将荧光引物对步骤(2)中的DNA进行PCR扩增(对F1和F2代DNA进行相同条件的扩增)，然后将PCR产物与分子内标(携带ROX的已知片段大小的DNA)混合，在测序仪上经过电泳分离，通过使用分子量内标法，进行鉴定。