[发明专利]一套用于单增李斯特菌检测的多核苷酸、方法和试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于单核细胞增生李斯特菌检测的多核苷酸、方法和试剂盒。具体地本发明中公开了可用作单核细胞增生李斯特菌实时荧光PCR检测标准分子的多核苷酸和DNA构建物LY01和LY02。本发明的质粒标准分子解决了单核细胞增生李斯特菌实时荧光PCR检测中标准物质缺乏的难题，保证单核细胞增生李斯特菌实时荧光PCR方法检测结果的可比性，为单核细胞增生李斯特菌实时荧光PCR方法检测提供了可靠质量控制方法。

技术领域

本发明涉及一套生物工程技术领域的质粒分子，具体涉及一套用于单增李斯特菌检测的多核苷酸、方法和试剂盒。

背景技术

单核细胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)归属于李斯特菌属(Listeria)。单核细胞增生李斯特菌是李斯特菌属中唯一对人致病的病菌，是一种重要的人兽共患和食品卫生病原菌，该菌主要通过肉乳及其制品引起人的感染发病，能引起人和动物脑膜炎败血症及孕妇流产等，故已引起世界多国相关部门的重视。

目前单核细胞增生李斯特氏菌的检测方法分为两类,一类是传统的培养及其改进方法，依赖于生化与形态学特点，检测周期较长，可操作性差；一类是聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)相关方法，包括普通PCR方法以及实时荧光PCR方法，主要是针对单核细胞增生李斯特氏菌区别于李斯特菌属其它细菌的多个靶基因，选择特异序列，建立PCR以及实时荧光PCR方法。单核细胞增生李斯特氏菌PCR相关检测方法近年来发展迅速，由于其快速、灵敏、特异的特性，已经成为食源性病原微生物的可靠检测方法。

质粒DNA标准物质是一套含有检测目的基因的特异性片段的重组质粒分子，在PCR定性检测中可以作为阳性对照，在PCR定量分析中可以作为定量分析的标准品，构建定量分析的标准曲线。目前质粒DNA分子作为基因检测的标准物质得到了越来越多的深入研究和应用，但是针对单核细胞增生李斯特氏菌实时荧光PCR检测方法的质粒DNA标准物质还是空白。在实际单核细胞增生李斯特氏菌实时荧光PCR时，各单位使用的多是自行设计构建的质粒DNA分子作为标准品，其中的目的基因特异性片段各不相同，同时缺乏统一的定值方法，质粒DNA分子定值准确度差，造成各实验室之间的检测结果差异极大，缺乏可比性。

发明内容

本发明的目的在于提供一套适用于单增李斯特菌实时荧光定量PCR检测的质粒标准分子及其应用。

本发明的另一目的是提供一套适用于致病型单增李斯特菌实时荧光定量PCR检测的质粒标准分子及其应用。

本发明的第一方面，提供了一套分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含单增李斯特菌的内化素基因InlA基因序列和/或单增李斯特菌的转录激活调节蛋白基因prfA基因序列。

在另一优选例中，所述单增李斯特菌内化素基因InlA的基因序列选自下组：

(a)序列如SEQ ID NO.:3所示的多核苷酸序列；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO.:3所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸序列；

(c)序列与SEQ ID NO.:3所示多核苷酸完全匹配或完全互补并且长度为SEQ IDNO.:3所示序列长度的20％-100％(较佳地50％-100％，更佳地80％-100％，最佳地90％-100％，如95％)的多核苷酸序列；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。

在另一优选例中，所述单增李斯特菌的转录激活调节蛋白基因prfA基因序列选自下组：

(a)序列如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸序列；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸序列；